miR-485-5p在前列腺癌組織中表達(dá)的臨床意義及對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響①

胡海峰 楊 進(jìn) 陳 林 汪自力 王云漢

(成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,成都 610081)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是臨床常見泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其病死率在各類泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中排第二，給患者的生命安全造成巨大威脅[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，目前PC的治療方案可明顯提高患者生存率，但復(fù)發(fā)率依然很高，且對(duì)于晚期PC患者尚缺乏有效治療手段[2]。因此，尋找更有效的治療方案提升PC患者生存率已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞生長發(fā)育、增殖分化及腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。

miR-485-5p是miRNAs家族成員之一，為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，與胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展顯著相關(guān)，因此miR-485-5p具有成為惡性腫瘤防治新靶點(diǎn)的潛質(zhì)[4,5]。但是，目前鮮見miR-485-5p在PC組織中表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究。為此，本研究分析PC組織及細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究miR-485-5p對(duì)PC生物學(xué)行為的影響，闡述miR-485-5p在PC防治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病理組織及細(xì)胞系 收集本院病理科2014年4月至2018年5月存檔的石蠟包埋PC組織及其匹配癌旁組織(距離手術(shù)邊緣>2 cm)45例。所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷為PC，術(shù)前均未接受任何形式放化療治療。人PC細(xì)胞系LNCaP、22RV1、PC-3 來源于上海 ATCC 細(xì)胞庫。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 DEME細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Life Technology公司)；胰酶、胎牛血清(美國ScienCell公司)；TRIzol 試劑盒(美國 Invitrogen 公司)；miR-485-5p類似物(mimic)及陰性對(duì)照空載體質(zhì)粒(上海吉瑪生物公司)；兩步法RNA提取試劑盒(Fermentas公司)；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾公司)；離心機(jī)(意大利A.L.C 公司)、流式細(xì)胞儀(美國FCMXBD公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測miR-485-5p表達(dá) 采用TRIzol 試劑盒提取PC組織、癌旁組織及各PC細(xì)胞系中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。選擇待檢測基因的合適上下游引物，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增待檢測基因。以GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增結(jié)束后繪制溶解曲線，采用2-ΔΔCt計(jì)算各組組織及細(xì)胞中miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將PC細(xì)胞系中miR-485-5p表達(dá)最低的細(xì)胞系(LNCaP)分散于細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/孔，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。將細(xì)胞分為miR-485-5p mimic組(miR組)和陰性對(duì)照組(NC組)。轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞，將miR-485-5p mimic轉(zhuǎn)染于miR組細(xì)胞中，將對(duì)照空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NC組細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長期的miR組及NC組細(xì)胞，制備密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，200 μl/孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入15 μl MTT溶液(質(zhì)量濃度為5 mg/ml)，37℃孵育4 h。棄上清，各孔加入100 μl DMSO溶解MTT結(jié)晶，輕輕振蕩，10 min后酶標(biāo)儀測OD值(λ=490 nm)，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48及72 h后，采用PBS清洗細(xì)胞，離心后去上清。按照試劑盒說明書操作：用緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC 染色，并于暗處室溫孵育15 min，再加入5 μl PI染色，靜置5 min后用流式細(xì)胞儀檢測其凋亡情況。每組重復(fù)3次計(jì)算平均值。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48及72 h后，收集各組處于對(duì)數(shù)期生長的LNCaP細(xì)胞，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中孵育，待細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)，采用槍頭(200 μl)垂直于6孔板底部做橫線劃痕，倒置熒光顯微鏡觀察劃痕區(qū)域?qū)挾炔⑴恼?。隨后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中孵育24 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察劃痕區(qū)域?qū)挾茸兓⑴恼?。采用ImageJ軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾龋⒂?jì)算各組細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞劃痕愈合率，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 取100 μl稀釋完成的基質(zhì)膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48及72 h后，分別取各組對(duì)數(shù)期生長的LNCaP細(xì)胞，胰酶消化后將細(xì)胞濃度調(diào)至2×105個(gè)/ml。取100 μl細(xì)胞懸液加于上室，下室加入等量含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出，按照說明書進(jìn)行固定、染色，膜的下室面表面細(xì)胞為侵襲細(xì)胞，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值。

2 結(jié)果

2.1PC組織及細(xì)胞中miR-485-5p表達(dá) PC組織中miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織(Control)(P<0.05，圖1)。在3種PC細(xì)胞系中，LNCaP細(xì)胞中miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量最低，將其作為后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

2.2miR-485-5p表達(dá)水平與PC患者病理參數(shù)的關(guān)系 PC組織中miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量為0.62±0.09，以此為分界點(diǎn)，將45例PC組織分為高表達(dá)組(18例)及低表達(dá)組(27例)。收集兩組患者的各項(xiàng)臨床資料，發(fā)現(xiàn)PC組織中miR-485-5p低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高臨床病理分級(jí)(G3)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)相關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3轉(zhuǎn)染對(duì)LNCaP細(xì)胞miR-485-5p相對(duì)表達(dá)水平及增殖抑制的影響 轉(zhuǎn)染24 h、48 h及72 h后miR組miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量均明顯高于NC組(P<0.05，圖2A)。隨著孵育時(shí)間延長，miR組細(xì)胞抑制率明顯升高(P<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)miR組細(xì)胞抑制率明顯高于NC組(P<0.05，圖2B)。

2.4轉(zhuǎn)染miR-485-5p對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的影響 隨著孵育時(shí)間延長，miR組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)miR組細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組(P<0.05，圖3)。

2.5轉(zhuǎn)染miR-485-5p對(duì)LNCaP細(xì)胞遷移的影響 隨著孵育時(shí)間延長，miR組及NC組細(xì)胞劃痕愈合率明顯升高(P<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)NC組劃痕愈合率明顯高于miR組(P<0.05，圖4)。

2.6轉(zhuǎn)染miR-485-5p對(duì)LNCaP細(xì)胞侵襲的影響

表1 miR-485-5p表達(dá)與PC患者病理參數(shù)的關(guān)系

Tab.1 Relationship between miR-485-5p expression and pathological parameters of patients with PC

ClinicopathologicparamentersClassificationmiR-485-5pHigh expressionLow expressionχ2PAge≦608140.2370.626>601013BPHYes9150.1340.714No912Histopathological classificationG1-G24177.2020.007G31410Lymphatic metastasisYes52111.0680.001No136TNM stageⅠ+Ⅱ1074.5250.033Ⅲ+Ⅳ820

圖1 PC組織及細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)Fig.1 miR-485-5p expressions in PC tissues and cells

圖2 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后各組細(xì)胞miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量比較及增殖抑制率比較Fig.2 Comparison of relative expression of miR-485-5p and inhibition rates of cells in each group after transfection for different timeNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖3 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后各組細(xì)胞凋亡率比較Fig.3 Comparison of apoptosis rates of cells in each group after transfection for differnt timeNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖4 各組細(xì)胞劃痕愈合率比較Fig.4 Comparison of cell scratch healing rates in each groupNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖5 各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較Fig.5 Comparison of number of invasive cells in each groupNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

隨著孵育時(shí)間延長，miR組及NC組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)NC組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于miR組(P<0.05，圖5)。

3 討論

PC的發(fā)生及發(fā)展是十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，有多種基因參與調(diào)節(jié)。既往研究證實(shí)，miRNA可用于PC的診斷與治療，異常表達(dá)miRNA譜可用于預(yù)測PC患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況，從PC組織中異常表達(dá)的miRNA入手可能有助于闡明PC的發(fā)病機(jī)制，找到新的治療靶點(diǎn)[6,7]。miR-485-5p是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，可通過調(diào)節(jié)靶向基因發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與乳腺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。Sun等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-485-5p在肝癌細(xì)胞中可通過靶向結(jié)合STC2下調(diào)其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。Wang等[10]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-485-5p在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-485-5p表達(dá)水平可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移。本研究中，相較于癌旁組織，PC組織中miR-485-5p表達(dá)量明顯降低，提示miR-485-5p與PC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Yang等[11]也通過對(duì)比研究證實(shí)PC組織中miR-485-5p表達(dá)量明顯低于正常前列腺組織，與本研究結(jié)果一致。為探究miR-485-5p在PC防治中的價(jià)值，本研究進(jìn)一步分析miR-485-5p與PC患者各項(xiàng)病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-485-5p表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分級(jí)及TNM分期相關(guān)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分級(jí)高及TNM分期晚的患者miR-485-5p表達(dá)水平明顯降低，提示miR-485-5p可能通過參與PC惡變、生長及轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌作用。

增殖能力增強(qiáng)、凋亡減少及遷移與侵襲能力的提升是腫瘤常見的生物學(xué)特性，亦是腫瘤生長、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[12]。多項(xiàng)研究表明，miRNA在參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程時(shí)，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)行為，包含增殖、凋亡、侵襲及遷移等[13]。Kang等[14]研究顯示，miR-485-5p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯降低，其可通過負(fù)向調(diào)控FLOT1抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。而Wu等[15]研究證實(shí)，miR-485-5p可通過負(fù)向調(diào)控FZD7進(jìn)而抑制黑色素瘤的侵襲及增殖，且其過表達(dá)后可明顯抑制Wnt信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑癌作用。目前，miR-485-5p對(duì)PC細(xì)胞各類生物學(xué)行為的影響尚不明確。本研究所檢測的3類PC細(xì)胞系中LNCaP細(xì)胞miR-485-5p表達(dá)量最低，因此本研究選用LNCaP細(xì)胞，通過各項(xiàng)生物學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究miR-485-5p對(duì)PC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。轉(zhuǎn)染后，miR組細(xì)胞miR-485-5p表達(dá)量明顯高于其他組，說明miR-485-5p轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-485-5p可明顯抑制LNCaP細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明miR-485-5p在PC患者中的抑癌作用可能是通過抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)的。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-485-5p可直接與PC細(xì)胞中RBM5的3′UTR結(jié)合，通過提升RBM5的表達(dá)量抑制PC細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡這可能是miR-485-5p抑制PC發(fā)展的作用機(jī)制。國內(nèi)外大量研究證實(shí)，侵襲及轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者復(fù)發(fā)及生存期長短最主要的因素，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移是降低復(fù)發(fā)率、延長生存時(shí)間的關(guān)鍵[17-19]。本研究對(duì)各PC患者的臨床資料分析結(jié)果顯示，低表達(dá)miR-485-5p的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率明顯增大，提示miR-485-5p與PC細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而提升miR-485-5p表達(dá)可顯著抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此外，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-485-5p后，其細(xì)胞侵襲及遷移能力均明顯降低，進(jìn)一步說明miR-485-5p可抑制PC細(xì)胞的侵襲及遷移。Yang等[20]研究顯示，通過提升PC細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)，可明顯抑制細(xì)胞增殖，并降低其發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率，與本研究結(jié)果一致。研究結(jié)果表明miR-485-5p具有抑制PC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，并促進(jìn)凋亡的作用，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能作為一種抑癌基因在PC中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。

綜上所述，PC組織及細(xì)胞中miR-485-5p表達(dá)水平降低，且與病理分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)miR-485-5p水平可明顯抑制PC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡，在PC的防治中具有較大的潛能。但是，研究顯示miRNA并不具有蛋白質(zhì)編碼功能，是通過靶向下游基因發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，本研究中只是初步探討miR-485-5p在PC中的表達(dá)及生物學(xué)功能，而其具體的下游靶基因及相應(yīng)的作用機(jī)制將作為后續(xù)研究。