miR-1靶向調(diào)控VEGFA肺癌干細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響①

羅繼文 陳光明 岑小波

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院胸心外科,瀘州 646000)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，腫瘤相關(guān)病死率位居惡性腫瘤榜首。數(shù)據(jù)顯示2018年肺癌新發(fā)確診病例約占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的15%左右，死亡病例約占全部惡性腫瘤死亡病例的25%左右。雖然肺癌的治療取得了一定進(jìn)展，但是肺癌患者5年生存率仍然較低，僅有15%左右[1-3]。目前已經(jīng)證實(shí)肺癌細(xì)胞中存在多種基因突變，包括EGFR、KRAS、p53和PTEN等基因，但是肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全明確[4,5]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)密不可分，CSCs在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等生物過程中均發(fā)揮重要作用[6-8]，攻克CSCs將為腫瘤的治療帶來巨大希望。研究表明CSCs受多種因素的調(diào)控等，包括遺傳、表觀遺傳和腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，miRNAs屬于表觀遺傳學(xué)范疇，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其異常表達(dá)可引起包括人類惡性腫瘤在內(nèi)的疾病，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以調(diào)控CSCs的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，并發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-14]。miR-1在肺癌、肝癌、卵巢癌和前列腺癌等常見惡性腫瘤中被鑒定為抑癌因子，在乳腺癌中miR-1表達(dá)下調(diào)，可抑制乳腺癌CSCs的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[15-19]。而miR-1與肺癌CSCs的研究尚未見報(bào)道，因此本文探討miR-1調(diào)控肺癌CSCs生物學(xué)功能的作用機(jī)制，旨在獲得miR-1作為肺癌潛在作用靶點(diǎn)的重要證據(jù)，為肺癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 膠原酶購自美國Sigma公司；表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子購自美國Gibco公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-1、VEGFA、內(nèi)參GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成； DMEM-F12培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司；miR-1 mimic和oe-VEGFA質(zhì)粒購自廣州瑞博公司；Boyden和Transwell小室且美國Coring公司；Nanog、SOX2和OCT4購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1肺癌CSCs的分離培養(yǎng) 收集我院行手術(shù)治療的肺癌患者術(shù)切除的新鮮組織，患者術(shù)前未接受抗腫瘤治療，經(jīng)病理學(xué)專家證實(shí)為肺癌組織。操作符合我院倫理委員會(huì)要求，所有患者知情同意。離體的新鮮組織立即置于組織保存液中，在無菌環(huán)境下去除癌旁組織，生理鹽水沖洗后，剪成米粒大小放入含有膠原酶的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中，37℃搖床上消化2 h。消化終止后，無菌尼龍細(xì)胞過濾器過濾棄去組織塊，消化細(xì)胞液2 000 r/min離心5 min，將細(xì)胞重懸置于含有表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，2周左右時(shí)腫瘤細(xì)胞球形成，將腫瘤細(xì)胞球制成單個(gè)細(xì)胞后與小鼠抗人CD133抗體包被的磁珠孵育，分選出CD133陽性細(xì)胞，并置于無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集CD133陽性和CD133陰性的細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，-80℃凍存過夜，超聲裂解30 min后12 000 r/min、4℃離心20 min，檢測(cè)蛋白濃度，煮沸變性，冷卻后，蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Nanog、SOX2、OCT4一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗3次后，二抗室溫孵育1 h，ELC化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的肺癌CSCs細(xì)胞傳代至6 cm培養(yǎng)皿中，按說明書將脂質(zhì)體2000與轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，分為NC組和miR-1 mimic組。miR-1 mimic和vector、miR-1 mimic和oe-VEGFA分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，分為miR-1 vector組和miR-1 VEGFA組，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)CSCs中miR-1表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞系，采用Trizol裂解法提取總RNA。設(shè)計(jì)合成miR-1。引物見表1。總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，95℃預(yù)變性5 s，95℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。測(cè)得各樣品的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，2-ΔΔCt法計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-1相對(duì)表達(dá)量，GAPDH為內(nèi)參計(jì)算VEGFA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取各組細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔、100 μl無血清培養(yǎng)基接種于Boyden小室上室，下室加500 μl完全培養(yǎng)基作為趨化因子，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察下室穿入細(xì)胞情況，下室穿入10個(gè)左右細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)，將Boyden小室和下室之間聚碳酸酯微孔膜的上室面細(xì)胞洗去后用甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)微孔膜下室面3個(gè)視野中的細(xì)胞，取其均值代表細(xì)胞侵襲能力。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GroupsPrimer sequence miR-1FGCCCGCTGGAATGTAAAGAAGTATGRGTGCAGGGTCCGAGGTVEGFAFCGCTTCGGCAGCACATATACRAGGGGCCATGCTAATCTTCTU6FAGGGCAGAATCATCACGAAGTRAGGGTCTCGATTGGATGGCAGAPDHFACAACTTTGGTATCGTGGAAGGRGCCATCACGC CACAGTTTC

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 取各組細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔、100 μl無血清培養(yǎng)基接種于Transwell小室上室，下室加500 μl完全培養(yǎng)基作為趨化因子，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察下室細(xì)胞穿入情況，下室穿入10個(gè)左右細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)，將Transwell小室和下室之間聚碳酸酯微孔膜的上室面細(xì)胞洗去后用甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)微孔膜下室面3個(gè)視野中的細(xì)胞，取其均值代表細(xì)胞侵襲能力。

1.2.7miR-1靶向調(diào)控VEGFA驗(yàn)證 Target Scan7.1軟件預(yù)測(cè)miR-1的靶基因。分別將以下4組物質(zhì)共轉(zhuǎn)染到CSCs中：VEGFA-wt與miR-1 mimic共轉(zhuǎn)染組(VEGFA-wt+miR-1)；VEGFA-wt與NC共轉(zhuǎn)染組(VEGFA-wt+NC)；VEGFA-mut與miR-1 mimic共轉(zhuǎn)染組(VEGFA-mut+miR-1)；VEGFA-mut與NC共轉(zhuǎn)染組(VEGFA-mut+NC)，收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)說明書檢測(cè)各組熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1肺癌CSCs的篩選及鑒定 與CD133陰性細(xì)胞相比，CD133陽性細(xì)胞中Nanog、OCT4和SOX2的表達(dá)顯著增加，表明CD133陽性的細(xì)胞為肺癌CSCs，置于無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2肺癌CSCs 中miR-1的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)CSCs中miR-1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-1在CD133陰性細(xì)胞中的表達(dá)為1.00±0.05，在CD133陽性細(xì)胞(CSCs)中的表達(dá)為0.31±0.10，CSCs中miR-1的表達(dá)降低(P<0.05)。

2.3miR-1 mimic轉(zhuǎn)染效果 miR-1 mimic轉(zhuǎn)染CSCs 48 h后，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-1在NC組細(xì)胞中的表達(dá)為1.00±0.04，在miR-1 mimic組細(xì)胞中的表達(dá)為13.25±0.27，miR-1 mimic組CSCs中miR-1的表達(dá)升高(P<0.05)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4miR-1對(duì)肺癌CSCs侵襲能力的影響 Boyden實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為(78.31±12.67)個(gè)，miR-1 mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)為(19.53±6.92)個(gè)。與NC組比較，miR-1 mimic組細(xì)胞侵襲能力降低(P<0.05)。見圖2。

2.5miR-1對(duì)肺癌CSCs轉(zhuǎn)移能力的影響 Trans-well實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為(69.95±9.67)個(gè)，miR-1 mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)為(37.36±8.61)個(gè)。與NC組比較，miR-1 mimic細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.05)。見圖3。

2.6miR-1對(duì)VEGFA的調(diào)控作用 TargetScan7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示VEGFA啟動(dòng)子區(qū)有miR-1的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)結(jié)果顯示：與VEGFA-wt+NC共轉(zhuǎn)染組相比，VEGFA-wt+miR-1共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而VEGFA-mut+NC和VEGFA-mut+miR-1組之間的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組1.00±0.05比較，miR-1 mimic組CSCs中VEGFA mRNA表達(dá)水平0.39±0.09下降(P<0.05)。見圖4。

圖1 干性標(biāo)志蛋白Nanog、OCT4和SOX2在CD133細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of stem marker proteins Nanog，OCT4，SOX2 in CD133 cells

圖2 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-1對(duì)肺癌CSCs侵襲能力影響Fig.2 Effect of miR-1 on invasion of CSCs detected by Boyden test

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-1對(duì)肺癌CSCs轉(zhuǎn)移能力影響Fig.3 Effect of miR-1 on metastasis of CSCs detected by Transwell test

圖4 miR-1對(duì)VEGFA的調(diào)控作用Fig.4 Regulatory effect of miR-1 on VEGFANote: A.TargetScan7.1 software was used to predicte binding site of VEGFA and miR-1;B.Double luciferase reporter gene test was used to detect VEGFA targeting of miR-1;C.qRT-PCR was used to detect expression level of VEGFA mRNA in miR-1 mimic group;compared with NC group,*.P<0.05.

圖5 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGFA對(duì)轉(zhuǎn)染miR-1的CSCs侵襲能力的影響Fig.5 Boyden test was used to detect effect of VEGFA on invasive ability of CSCs transfected with miR-1

2.7VEGFA逆轉(zhuǎn)miR-1抑制肺癌CSCs侵襲能力 Boyden實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1 vector組穿膜細(xì)胞數(shù)為(13.74±7.54)個(gè)，miR-1 VEGFA組穿膜細(xì)胞數(shù)為(46.34±10.78)個(gè)。與miR-1 vector組比較，miR-1 VEGFA組細(xì)胞侵襲能力升高(P<0.05)。見圖5。

2.8VEGFA逆轉(zhuǎn)miR-1抑制肺癌CSCs轉(zhuǎn)移能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1 vector組穿膜細(xì)胞數(shù)為(13.74±7.54)個(gè)，miR-1 VEGFA組穿膜細(xì)胞數(shù)為(46.34±10.78)個(gè)。與miR-1 vector組比較，miR-1 VEGFA組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGFA對(duì)轉(zhuǎn)染miR-1肺癌CSCs轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.6 Transwell test was used to detect effect of VEGFA on metastasis of CSCs transfected with miR-1

3 討論

肺癌傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)切除、放療和化學(xué)治療，以手術(shù)切除為主放化療為輔方式的聯(lián)合治療對(duì)早期肺癌患者治療效果顯著，而大約三分之二的肺癌患者由于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官，使得傳統(tǒng)治療效果不佳[20,21]。腫瘤早期接受治療的患者及治療過程中產(chǎn)生耐藥的患者腫瘤復(fù)發(fā)率為50%，解決腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)耐藥問題是肺癌治療的關(guān)鍵[22,23]。雖然新肺癌治療策略如酪氨酸激酶抑制劑靶向治療和免疫療法等的出現(xiàn)使療效有一定改善，但由于肺癌在腫瘤細(xì)胞類型和遺傳、表觀遺傳調(diào)控中具有強(qiáng)異質(zhì)性，導(dǎo)致肺癌患者整體5年生存率并無明顯提高[24,25]，因此需要新的治療方法。最新研究表明，CSCs是腫瘤細(xì)胞中一種罕見的亞群，具有干細(xì)胞典型特征即具有持續(xù)自我更新能力和多分化潛能，且具有高體內(nèi)致瘤性，因此，CSCs與腫瘤的惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)耐藥和異質(zhì)性等密切相關(guān)，抑制CSCs可顯著抑制腫瘤惡性行為[6-10]。研究已經(jīng)證實(shí)CSCs可以作為藥物治療新靶點(diǎn)[26]，研究調(diào)控CSCs侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要意義。

CSCs的調(diào)控機(jī)制具有多樣性，USP37基因在乳腺癌CSCs中過表達(dá)，通過調(diào)控hedgehog信號(hào)通路增加CSCs的干性[27]；敲低Linc-ITGB1的表達(dá)可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌CSCs的形成和SOX2、Nanog、Oct-4、c-Myc和CD133等干性相關(guān)基因的表達(dá)[28]；在卵巢癌中抑制miR-23a的表達(dá)，CSCs的細(xì)胞活力、遷移、侵襲、和自我更新能力降低，凋亡增加，作用機(jī)制可能為靶向調(diào)控DLG2基因[29]。miRNAs屬于內(nèi)源性非編碼RNA家族，是長(zhǎng)度平均約為22個(gè)核苷酸的小RNA，其異常表達(dá)可以導(dǎo)致包括惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)生，肺癌細(xì)胞中存在miRNAs異常表達(dá)譜，可充當(dāng)癌基因促進(jìn)肺癌惡性進(jìn)展[12-14]。研究報(bào)道m(xù)iRNAs在肺癌細(xì)胞中可充當(dāng)藥物靶點(diǎn)，在肺癌細(xì)胞中miR-100-5p可逆轉(zhuǎn)克唑替尼和洛瑞肽的抗性，是抗藥性的潛在治療靶標(biāo)[30]；miR-1是心肌細(xì)胞發(fā)育增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育期間，可在心肌細(xì)胞中檢測(cè)到miR-1表達(dá)，出生后表達(dá)急劇上調(diào)[31]。大量文獻(xiàn)表明miR-1在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在肺癌中為抑癌因子，抑制肺癌細(xì)胞的致瘤性、侵襲轉(zhuǎn)移和增加肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[15-18]。在乳腺癌中過表達(dá)miR-1可抑制CSCs增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]，因此miR-1是否參與肺癌CSCs調(diào)控引起關(guān)注。

CSCs是存在于腫瘤細(xì)胞中的一個(gè)亞群，對(duì)其研究時(shí)首先將其分離并擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物或側(cè)群進(jìn)行分選[32]，本研究中CSCs來自肺癌組織，利用CSCs強(qiáng)大的自我更新能力，在無血清培養(yǎng)基中形成腫瘤細(xì)胞球，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CD133為肺癌CSCs表面標(biāo)志[33,34]，采用表面包被CD133抗體的磁珠分離出腫瘤球中CD133陽性的細(xì)胞，并采用Western blot檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞中干性標(biāo)志蛋白Nanog、OCT4和SOX2的表達(dá)情況，與CD133陰性細(xì)胞相比，CD133陽性細(xì)胞中干性標(biāo)志蛋白的表達(dá)均增加，表明分選出的CD133陽性細(xì)胞為肺癌CSCs。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1在CSCs中表達(dá)下調(diào)，可能為抑癌因子，進(jìn)一步在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1 mimic研究miR-1的生物學(xué)功能，過表達(dá)miR-1后CSCs侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。miRNAs與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平通過使mRNA去穩(wěn)定化和沉默抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)[35,36]，而miRNAs的靶基因可以通過TargetScan7.1軟件預(yù)測(cè)出，VEGFA是miR-1的靶基因之一，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)VEGFA基因3′-UTR區(qū)存在miR-1的結(jié)合位點(diǎn)，VEGFA為miR-1直接調(diào)控的靶基因。VEGFA屬于VEGF家族，在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，是最相關(guān)的促血管生成因子，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，腫瘤血管生成在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要促進(jìn)作用[37,38]。VEGFA在肺癌轉(zhuǎn)移組織中高表達(dá)，敲除VEGFA可減少體內(nèi)肺癌轉(zhuǎn)移[39]。VEGFA除可促進(jìn)血管生成外，還可通過上調(diào)SOX2驅(qū)動(dòng)CSCs的擴(kuò)增，促進(jìn)CSCs的轉(zhuǎn)移[40]。miR-1是否通過調(diào)控VEGFA抑制肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移引起本課題組的關(guān)注，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1抑制VEGFA mRNA的表達(dá)，Boyden和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VEGFA在CSCs中逆轉(zhuǎn)miR-1對(duì)CSCs侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。表明miR-1通過靶向負(fù)調(diào)控VEGFA抑制肺癌CSCs侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-1于肺癌CSCs中低表達(dá)，在CSCs過表達(dá)miR-1顯著抑制CSCs的轉(zhuǎn)移和侵襲，其初步機(jī)制可能是miR-1通過負(fù)調(diào)控VEGFA發(fā)揮作用，miR-1可能是肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。