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    miR-133a-3p通過(guò)抑制氧化還原因子1抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為①

    2020-06-06 04:33:10李天雄孫志鵬阿民布和張能維
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年10期
    關(guān)鍵詞:肝癌檢測(cè)研究

    李天雄 孫志鵬 尹 剛 閆 巍 阿民布和 張能維

    (首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院胃腸肝膽腫瘤外科,北京 100038)

    肝癌在我國(guó)的發(fā)病率逐年升高,對(duì)國(guó)民的身體健康構(gòu)成極大危害。作為一種惡性腫瘤,多種因素參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,其高轉(zhuǎn)移性和侵襲性是個(gè)多步驟發(fā)生的過(guò)程[1]。隨著現(xiàn)代人生活方式的改變,肝癌的發(fā)病率越來(lái)越高,發(fā)病人群也越來(lái)越年輕,但其發(fā)病原因尚不明確。研究證明miRNA具有與癌癥進(jìn)展相關(guān)的多種生物學(xué)作用,包括細(xì)胞的存活、分化、增殖、凋亡、遷移。許多研究已經(jīng)證明miRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。有報(bào)道指出miR-494可以通過(guò)靶向Ⅰ型膠原α1基因(collagen type I alpha 1,COL1A1)加劇口腔鱗狀細(xì)胞癌[3,4];miR-33a通過(guò)靶向核轉(zhuǎn)錄因子GATA6抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的活力和侵襲[5]。同時(shí),文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-133可作為腫瘤抑制因子在多種轉(zhuǎn)移性癌癥中發(fā)揮作用,并證明miR-133通過(guò)直接靶向垂體腺瘤中的叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1,FOXC1)來(lái)抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。研究證實(shí)miR-133的高表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。然而,沒(méi)有明確的證據(jù)表明miR-133a-3p與肝癌之間的關(guān)系。有研究證明氧化還原因子1(redox factor-1,Ref-1)可以作為腫瘤啟動(dòng)子調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程,其與腫瘤和其他疾病密切相關(guān)[8]。Guo等[9]發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中Ref-1的表達(dá)水平顯著上升,Ref-1的高表達(dá)導(dǎo)致患者術(shù)后總體存活率更差。Lee等[10]已證實(shí)Ref-1有助于人膀胱癌的分化和轉(zhuǎn)移。雖然不同的文獻(xiàn)報(bào)道揭示Ref-1與多種不同腫瘤之間的結(jié)合相互作用,但是Ref-1與肝癌之間關(guān)系鮮有報(bào)道。

    本研究主要探討miR-133a-3p是否可以抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性,并進(jìn)一步研究其與Ref-1的關(guān)系,揭示兩者之間相互作用對(duì)肝癌進(jìn)展內(nèi)在機(jī)制的影響。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1組織樣本 從2017年2月~2018年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院接受腹腔鏡精準(zhǔn)肝切除術(shù)的肝癌患者獲得23對(duì)肝癌組織和鄰近肝癌組織樣品。將組織樣品立即冷凍并儲(chǔ)存在液氮中?;颊吆图覍賹?duì)本研究知情同意,且該研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.1.2試劑與儀器 HepG2、Huh-7、SK-Hep1、SMMC-7721和Hep-3B等肝癌細(xì)胞以及人正常肝細(xì)胞系HL-7702購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);miR-mimics、miR-NC購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司;蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸和磷鎢酸均購(gòu)自西安科昊生物有限公司;蛋白酶抑制劑購(gòu)自羅氏試劑生物有限公司,高糖DMEM培養(yǎng)基 、優(yōu)級(jí)胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購(gòu)自美國(guó) HyClone,青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛、天狼星紅染液、苯胺藍(lán)和蘇木素均購(gòu)自北京碧云天有限公司,Actin、N-cadherin、Snail、Slug抗體及兔二抗均購(gòu)自英國(guó) Abcam;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó) Advansta,Transwell小室購(gòu)自康寧;qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;生物芯片分析系統(tǒng)為Agilent Bioanalyzer 2100。

    1.2方法

    1.2.1qRT-PCR TRIzol試劑用于提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR檢測(cè)目的基因RNA的相對(duì)表達(dá)水平。設(shè)定反應(yīng)條件:95℃熱激活10 min,95℃10 s,60℃ 20 s,72℃ 35 s。2-ΔΔCt方法用于計(jì)算目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

    1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞隨機(jī)分配到不同組,用miR-133a-3p-mimics(miR-mimics)和相應(yīng)的陰性對(duì)照(miR-NC)轉(zhuǎn)染,設(shè)置未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做空白對(duì)照組(Control),每組包含3×105個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種在6孔板中,融合30%~40%。每次轉(zhuǎn)染使用miR-mimics和miR-NC(各20 nmol/L)。

    1.2.3CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔直接鋪板,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1~4 d。結(jié)束后每孔加入20 μl CCK-8試劑,避光3 h,搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm檢測(cè)細(xì)胞CCK-8混合液OD值進(jìn)行活力分析。

    1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),6孔板,每孔300個(gè)細(xì)胞,2 ml培養(yǎng)液,培養(yǎng)15 d后,PBS沖洗,室溫風(fēng)干,結(jié)晶紫染色,計(jì)數(shù)。

    1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,接種至6孔板,培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng),每孔2 ml DMEM培養(yǎng)液,細(xì)胞密度至80%時(shí),細(xì)胞劃痕,劃痕后更換無(wú)血清培養(yǎng)液,0 h、6 h、12 h各拍照一次。

    1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/ml,Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液600 μl,上室先鋪水化的BD膠基底膜,再加200 μl無(wú)血清細(xì)胞懸液。鋪板24 h后PBS沖洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,室溫自然風(fēng)干。結(jié)晶紫染色10 min,PBS沖洗3次,棉簽輕輕擦去上層未遷移的細(xì)胞,33%乙酸脫色,酶標(biāo)儀570 nm讀值。

    1.2.7RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 檢測(cè)RNA質(zhì)量,RNA完整性數(shù)(RIN)>8的樣品用于RNA-seq測(cè)定。首先用DNA酶Ⅰ處理RNA樣品以降解任何可能的DNA污染。然后通過(guò)使用Oligo(dT)磁珠富集mRNA。與片段化緩沖液混合,將mRNA片段化成短片段。然后通過(guò)隨機(jī)六聚體引物合成cDNA的第一鏈。加入緩沖液,dNTP,RNase H和DNA聚合酶Ⅰ以合成第二條鏈。用磁珠純化雙鏈cDNA。然后進(jìn)行末端修復(fù)和3′-末端添加單核苷酸A(腺嘌呤)。最后,將測(cè)序銜接子連接到片段上。通過(guò)PCR擴(kuò)增富集片段。在質(zhì)量控制(QC)步驟中,對(duì)樣品庫(kù)進(jìn)行鑒定和定量,測(cè)序文庫(kù)產(chǎn)物。將稱為原始讀數(shù)的初級(jí)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行QC檢測(cè)以確定是否需要重新測(cè)序。在QC之后,將原始讀數(shù)過(guò)濾成干凈的讀數(shù),與參考序列比對(duì)。進(jìn)行QC校準(zhǔn)以確定是否需要重新測(cè)序。比對(duì)數(shù)據(jù)用于計(jì)算參考基因的讀數(shù)分布和映射比率。比對(duì)結(jié)果通過(guò)QC后,進(jìn)行下游分析,包括基因表達(dá)和基于基因表達(dá)的深度分析,如:PCA、相關(guān)性、篩選差異表達(dá)基因(DEGs)等?;贒EG進(jìn)一步深度分析,包括GO富集分析、KEGG通路富集分析,聚類分析,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析和DEGs分析。

    表1 引物序列

    Tab.1 Sequences of primers

    GeneSequences(5′-3′)miR-133a-3pFATTTTTCCCTCGACACCCGATRTCCCAGCCGTAGACCAARef-1FAGCCAACGTTAACTGAGGAGTRGGCAAGTTGATTGGAGGGATGIGFBP1FAGCCAACGTTAAATGAGGACAGRGGCAAGTTGATTGATGGGAGGSSTFAGCCAAGAGTTAACTCGTGAGRGGCATTAGGATTGATGGAGGGβ-actinFACCCACTCCTCCACCTTTGRCACCACCCTGTTGCTGTAG

    1.2.8Western blot 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml,80%細(xì)胞密度時(shí)收集細(xì)胞,PBS洗滌1 min后加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解,30 min后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液,沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶封閉,PBST清洗,1∶1 000稀釋一抗,室溫孵育1 h后4℃過(guò)夜。次日反復(fù)清洗條帶,加二抗室溫孵育90 min,PBS反復(fù)沖洗,條帶發(fā)光拍照。

    1.2.9免疫組化 石蠟切片脫蠟和水化,修復(fù)抗原,滴加封閉液,加一抗,PBS沖洗,滴加生物素標(biāo)記的二抗,PBS沖洗。滴加鏈親和素-過(guò)氧化物酶溶液孵育。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封固,PBS 緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照,陽(yáng)性細(xì)胞槳著色為棕黃色。

    2 結(jié)果

    2.1miR-133a-3p在肝癌組織和癌旁組織以及不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 通過(guò)qRT-PCR對(duì)23對(duì)癌組織和癌旁組織進(jìn)行分析檢測(cè),結(jié)果顯示miR-133a-3p在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.05),見(jiàn)圖1A。提示miR-133a-3p在肝癌組織中表達(dá)過(guò)低可能與肝癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。檢測(cè)miR-133a-3p在五種肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7、SK-Hep1、SMMC-7721、Hep-3B和人正常肝細(xì)胞系HL-7702中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p在五種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)均低于HL-7702,在HepG2的表達(dá)最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1B。

    圖1 miR-133a-3p在各組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-133a-3p in tissuesNote: A.Expression of miR-133a-3p in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues;B. Expression of miR-133a-3p in five hepatocellular carcinoma cell lines and normal hepatocytes.***.P<0.001.

    圖2 miR-133a-3p在HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后各組中的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-133a-3p in HepG2 cells before and after transfectionNote: ***.P<0.001.

    圖3 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖及克隆形成能力變化Fig.3 Changes of cell proliferation ability and clonogenic ability before and after transfectionNote: A.CCK-8 was used to detect the changes of cell proliferation ability;B.Clonogenic assay was used to detect the changes of cell clonogenic ability.***.P<0.001.

    2.2HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖和克隆形成能力變化 miR-mimics和miR-NC分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,結(jié)果顯示miR-mimics轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞中miR-133a-3p表達(dá)顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖2。CCK-8檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示miR-133a-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖能力(P<0.05),見(jiàn)圖3A;克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示了同樣的結(jié)果,miR-133a-3p過(guò)表達(dá)后,HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖3B。

    2.3HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移和侵襲能力變化 細(xì)胞劃痕和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p在HepG2細(xì)胞過(guò)表達(dá)后可以抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力(P<0.05),見(jiàn)圖4。

    圖4 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞劃痕愈合能力及侵襲能力變化Fig.4 Changes of wound healing ability and invasive ability of HepG2 cells before and after transfect-ionNote: A.Wound healing ability;B.Invasive ability.**.P<0.005;***.P<0.001.

    圖5 RAN-seq檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后各基因RNA水平變化Fig.5 RAN-seq was used to detect changes of gene RNA levels in HepG2 cells before and after transfectionNote: Reds means up,blue means down.

    圖6 qRT-PCR檢測(cè)miR-mimics組細(xì)胞下調(diào)倍數(shù)最高的3個(gè)基因Fig.6 qRT-PCR was used to detect three genes with highest down-regulation ratio in miR-mimics groupNote:**.P<0.01.

    圖7 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Ref-1表達(dá)變化Fig.7 Expression of Ref-1 in HepG2 cells before and after transfectionNote: A.Detected with qRT-PCR;B.Detected with Western blot.***.P<0.001.

    圖8 Ref-1在各組織中的表達(dá)Fig.8 Expression of Ref-1 in tissuesNote:A.Expression of Ref-1 in hepatocellular carcinoma tissues and normal tissues(100 μm);B.Expression of Ref-1 in five hepatocellular carcinoma cell lines.***.P<0.001.

    圖9 聯(lián)合干預(yù)后HepG2細(xì)胞miRNA-133a-3p和Ref-1表達(dá)情況Fig.9 Expression of miRNA-133a-3p and Ref-1 in HepG2 cells after combined interventionNote:***.P<0.001.

    圖10 聯(lián)合干預(yù)后HepG2細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力變化Fig.10 Proliferation, migration and invasive ability of HepG2 cell after combined interventionNote:A.Proliferation;B.Migration;C.Invasive.

    2.4RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后各基因RNA差異變化 利用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)了HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后各基因在RNA水平表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)Ref-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP1)和可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)蛋白(soluble growth stimulating protein,SST)下調(diào)倍數(shù)位于前三名,通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其均與腫瘤增殖通路相關(guān),見(jiàn)圖5;用qRT-PCR對(duì)miR-mimics組HepG2細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與RNA-seq保持一直,其中Ref-1下調(diào)倍數(shù)最高(P<0.05),見(jiàn)圖6(所有結(jié)果均轉(zhuǎn)為正數(shù)計(jì)算)。

    2.5HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Ref-1表達(dá)變化 根據(jù)RNA-seq檢測(cè)分析結(jié)果, qRT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ref-1隨著miR-133a-3p的增加而降低,呈負(fù)相關(guān)作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖7。

    2.6Ref-1在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá) 免疫組化和qRT-PCR結(jié)果表明,Ref-1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05),見(jiàn)圖8A;在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常肝細(xì)胞系,且在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖8B。

    2.7miR-133a-3p和Ref-1聯(lián)合干預(yù)后HepG2細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力變化 HepG2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-mimics和si-Ref-1,進(jìn)行聯(lián)合干預(yù),結(jié)果顯示miR-mimics轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞中miR-133a-3p表達(dá)顯著增加,而Ref-1幾乎無(wú)表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖9。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示聯(lián)合干預(yù)后更加顯著地抑制了HepG2細(xì)胞增殖能力(P<0.05),見(jiàn)圖10A;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示了同樣的結(jié)果,聯(lián)合干預(yù)后HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力抑制效果更加明顯(P<0.05),見(jiàn)圖10B、C。

    3 討論

    肝癌被認(rèn)為是消化系統(tǒng)疾病惡性程度較高的癌癥之一,其發(fā)病率在我國(guó)逐年上升。盡管肝癌的治療已經(jīng)有所改善,但由于其存活率較低,目前研究熱點(diǎn)更多集中在肝癌新的靶向治療[11]?;蛑委熥鳛橐环N新策略,已經(jīng)取得了有效的成果。本研究主要關(guān)注miR-133a-3p和Ref-1在肝癌中的功能作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論,miR-133a-3p可通過(guò)靶向Ref-1抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲等惡性生物學(xué)行為,同時(shí)降低Ref-1的表達(dá)。

    有研究報(bào)道m(xù)iR-133a在不同類型的多種惡性腫瘤中作為一種腫瘤抑制因子起到抑制腫瘤的作用,尤其是在胃腸系統(tǒng)中。Zhang等[12]證明miR-133a可以有效抑制胃癌細(xì)胞周期進(jìn)程。同時(shí),Jia等[13]研究可知miR-133a可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制膀胱癌的細(xì)胞增殖和遷移。為了進(jìn)一步研究miR-133a-3p在肝癌中的作用和分子機(jī)制,本研究首先用qRT-PCR檢測(cè)miR-133a-3p在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示miR-133a-3p在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中顯著下調(diào),并且在HepG2細(xì)胞中下調(diào)倍數(shù)最高。在其他類型的人類惡性腫瘤中,如食管癌,肺癌,膀胱癌和結(jié)腸直腸癌等,有數(shù)據(jù)分析表明miR-133a-3p降低了腫瘤細(xì)胞的增殖,侵襲和遷移能力[14]。此外,CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)分析表明,miR-133a-3p的上調(diào)顯著抑制了HepG2細(xì)胞增殖和克隆形成能力,而細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-133a-3p過(guò)表達(dá)后明顯抑制了HepG2細(xì)胞的劃痕愈合能力和細(xì)胞侵襲能力,這些結(jié)果表明miR-133a-3p在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到腫瘤抑制因子的作用,其過(guò)表達(dá)后可以有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

    至于進(jìn)一步的機(jī)制,本研究假設(shè)miR-133a-3p通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因來(lái)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)能力。采用RNA-seq的方法,檢測(cè)了miR-133a-3p過(guò)表達(dá)前后HepG2細(xì)胞中基因在RNA水平的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ref-1、IGFBP1和SST在miR-133a-3p過(guò)表達(dá)后下調(diào)的倍數(shù)位于前三,隨后用qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果和RNA-seq的結(jié)果一致,其中Ref-1的下調(diào)倍數(shù)最高。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)miR-133a-3p過(guò)表達(dá)后Ref-1在RNA和蛋白水平的變化,結(jié)果顯示Ref-1隨著miR-133a-3p過(guò)表達(dá)而顯著降低,說(shuō)明miR-133a-3p對(duì)其具有抑制作用,靶向作用最強(qiáng)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Ref-1在多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁和正常組織。此外,較高的Ref-1的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸癌患者術(shù)后總體存活率降低。因此,為了找到證據(jù)證明Ref-1參與肝癌進(jìn)展的假設(shè),在本研究中,qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)Ref-1在肝癌細(xì)胞和組織中高度表達(dá),這與本課題組之前的生物信息學(xué)分析一致。最后,為了研究Ref-1在miRNA-133a-3p抑制肝癌過(guò)程中是否發(fā)揮了作用,本實(shí)驗(yàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了miR-mimics和si-Ref-1進(jìn)行聯(lián)合干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干預(yù)后肝癌細(xì)胞HepG2的惡性生物學(xué)行為的抑制作用與miR-mimics組相比更加強(qiáng)烈。進(jìn)一步證明Ref-1在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中充當(dāng)致癌基因的角色,沉默其表達(dá)與miR-mimics聯(lián)合干預(yù)后可以產(chǎn)生協(xié)同抑癌作用。

    綜上所述,本研究揭示了miR-133a-3p通過(guò)直接靶向Ref-1并降低其表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移等惡性生物學(xué)行為。通過(guò)大量的檢測(cè)和生物信息學(xué)分析,本研究對(duì)肝癌在基因水平發(fā)生機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí),同時(shí)為肝癌的臨床治療提供了可行的靶向治療策略,因此對(duì)肝癌無(wú)論是致癌機(jī)制還是治療思路都提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。臨床上晚期肝癌對(duì)放射治療不是很敏感,miR-133a-3p和Ref-1在肝癌放療治療過(guò)程中起什么作用,將是下一步研究的重點(diǎn)。

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