腦紋狀體內(nèi)植入CREB基因修飾的BMSCs對(duì)帕金森大鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的實(shí)驗(yàn)研究①

余 恒 宋光捷

(襄陽市中心醫(yī)院，湖北省文理學(xué)院附屬醫(yī)院北院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科，襄陽 441003)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以腦黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)使神經(jīng)元發(fā)生變性缺失為主要病理特征[1]。近年來其發(fā)病率隨人口老齡化逐漸上升，每年患病率達(dá)15/10萬～328/10萬人口，對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重影響[2]。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB)是一種調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、PKC等磷酸化后可參與調(diào)控機(jī)體學(xué)習(xí)記憶[3]。同時(shí)有研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)可通過腦內(nèi)移植改善PD大鼠靜止性震顫、動(dòng)作遲緩等運(yùn)動(dòng)障礙癥狀[4]。研究顯示PD患者學(xué)習(xí)記憶障礙與p-CREB表達(dá)異常密切相關(guān)[5]。然而目前未見CREB基因?qū)D大鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究。因此本研究就腦紋狀體內(nèi)植入CREB基因修飾BMSCs對(duì)PD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠37只，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)許可證SCXK(滬)2016-0002。

1.1.2試劑與儀器 眼科剪(上海千盛生物科技有限公司)，DMEM-LG培養(yǎng)液(北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司)，CO2培養(yǎng)箱(無錫旭野科技有限公司)，美國Thermo Scientific離心機(jī)，總RNA提取試劑盒(武漢鴻雨新科技有限公司)，DNA連接酶(北京合生基因科技有限公司)，Lipofectin 2000(美國Invitrogen公司)，戊巴比妥鈉溶液(石家莊北方藥業(yè)有限公司)，腦立體定位儀(北京吉安得爾科技有限公司)，乙醇(上海滬宇生物科技有限公司)，微量進(jìn)樣器(北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，6-羥基多巴胺(6-OHDA)溶液BCA試劑盒(北京寰宇科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)，阿撲嗎啡(APO)溶液(美國Sigma公司)，PBS溶液(上海哈靈生物科技有限公司)，研磨器(北京安智盈科技有限公司)，RIPA裂解液(上海迪申生物技術(shù)有限公司)，p-CREB一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，GAPDH一抗(上海合星生物科技有限公司)，山羊抗兔二抗(北京博爾西科技有限公司)，ECL發(fā)光試劑盒(美國Santa Cruz公司)，離心機(jī)(美國Thermo scientific)。

1.2方法

1.2.1CREB-BMSCs構(gòu)建 BMSCs分離培養(yǎng)：選取1只 Wistar大鼠處死，取出雙下肢股骨，眼科剪取股骨髁，PBS溶液沖洗骨髓腔，將獲得的骨髓細(xì)胞懸浮液使用離心機(jī)1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用DMEM-LG培養(yǎng)液重懸，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%以上消化、傳代，取第三代BMSCs用于后續(xù)研究。pCDNA3.1(+)-CREB表達(dá)載體構(gòu)建：取Wistar大鼠腦紋狀體，勻漿裂解，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與pCDNA3.1(+)同時(shí)用Xho I和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶30℃酶切過夜，電泳，回收pCDNA3.1(+)和CREB片段。pCDNA3.1(+)和CREB片段用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pCDNA3.1(+)-CREB表達(dá)載體。CREB-BMSCs構(gòu)建：取第三代BMSCs于6孔板中培養(yǎng)，其密度達(dá)到80%時(shí)，通過Lipofectin 2000將重組真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)-CREB轉(zhuǎn)染至BMSCs，構(gòu)建CREB-BMSCs。

1.2.2PD模型制備及分組 參照文獻(xiàn)[6]制備PD模型36只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，給予0.2 ml/100 g 2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射以麻醉大鼠，麻醉完成后將大鼠綁定于腦立體定位儀，頭部剃毛，顱頂75%乙醇消毒，沿正中線切開頭皮，暴露顱骨，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》定位大鼠腦紋狀體[6]，以微量進(jìn)樣器吸取8 μl 6-OHDA溶液注入大鼠腦紋狀體內(nèi)，縫合術(shù)口，麻醉恢復(fù)后正常飼養(yǎng)。造模后第2周，腹腔注射0.4 ml APO溶液，誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈，當(dāng)大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為時(shí)，計(jì)時(shí)30 min，每分鐘旋轉(zhuǎn)超過7圈的大鼠即為造模成功。選取造模成功大鼠30只，隨機(jī)分為PBS注射組、BMSCs移植組、CREB-BMSCs移植組，PBS注射組大鼠腦紋狀體內(nèi)注射10 μl PBS溶液，BMSCs移植組大鼠腦紋狀體內(nèi)注射10 μl BMSCs(1×104個(gè)/μl)，CREB-BMSCs移植組大鼠腦紋狀體內(nèi)注射10 μl CREB-BMSCs(1×104個(gè)/μl)。

1.2.3觀測(cè)項(xiàng)目 ①PD大鼠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)圈行為變化：移植2周、5周、8周后，腹腔注射APO誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈，當(dāng)大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為時(shí)開始計(jì)時(shí)，時(shí)長(zhǎng)為30 min，記錄每分鐘首尾相接旋轉(zhuǎn)的平均轉(zhuǎn)圈數(shù)。②PD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化：采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，具體如下：水迷宮為原形水池，水溫(23±2)℃，平臺(tái)位于西南象限，低于水面2 cm。首先進(jìn)行獲得性訓(xùn)練，將大鼠從西南、東南、東北、西北4個(gè)象限放入水中，大鼠爬上水下平臺(tái)5 s后結(jié)束該次訓(xùn)練，若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠至水下平臺(tái)停留10 s，共訓(xùn)練5 d，4次/d，每次間隔20 min。所有PD大鼠獲得性訓(xùn)練結(jié)束后第2天進(jìn)行空間探索測(cè)試，移除水下平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)象限放入池內(nèi)，讓其在圓形水池內(nèi)自由游泳，利用攝像裝置記錄大鼠30 s內(nèi)在目標(biāo)象限(原放置平臺(tái)的象限)內(nèi)停留時(shí)間。③PD大鼠腦紋狀體內(nèi)p-CREB蛋白水平變化：采用Western blot法檢測(cè)，具體如下：取各組大鼠，麻醉，迅速取出腦紋狀體，PBS清洗腦組織后置于研磨器內(nèi)，加RIPA裂解液裂解30 min，以離心機(jī)4℃離心10 min，提取蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，定量。取總蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，1∶500稀釋的p-CREB一抗、1∶1 000稀釋的GAPDH一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加入1∶20 000稀釋的山羊抗兔二抗，25℃孵育 90 min，洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯色，洗片后顯影、定影，分析p-CREB蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較3組PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、學(xué)習(xí)記憶能力變化、p-CREB表達(dá)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PD大鼠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)圈行為變化 移植2周、5周、8周后，BMSCs移植組PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯低于PBS注射組(P<0.05)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯低于BMSCs移植組(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2PD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化 移植2周、5周、8周后，BMSCs移植組PD大鼠在Morris水迷宮目標(biāo)象限內(nèi)的停留時(shí)間明顯多于PBS注射組(P<0.05)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠在Morris水迷宮目標(biāo)象限內(nèi)的停留時(shí)間明顯多于BMSCs移植組(P<0.05)，見表2、圖2。

2.3PD大鼠p-CREB蛋白水平變化 移植2周、5周、8周后，BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白水平明顯高于PBS注射組(P<0.05)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白水平明顯高于BMSCs移植組(P<0.05)，見表3、圖3。

Groups2 weeks5 weeks8 weeksPBS injection group11.11±0.8810.90±0.6910.69±0.70BMSCs transplantation group8.29±0.581)5.69±0.801)3.55±0.591)CREB-BMSCstransplantation group7.49±0.791)2)4.71±0.901)2)2.95±0.801)2)F62.53172.42376.32P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with PBS injection group,1)P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,2)P<0.05.

圖1 移植后PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)Fig.1 Number of rotations of PD rats after transplantationNote: Compared with PBS injection group，*.P<0.05；compared with BMSCs transplantation group，#.P<0.05.

Groups2 weeks5 weeks8 weeksPBS injection group8.66±1.309.95±1.0510.97±0.89BMSCs transplantation group11.71±1.291)15.18±1.411)19.35±1.491)CREB-BMSCstransplantation group14.29±0.881)2)20.42±1.301)2)26.38±1.751)2)F57.72171.98293.94P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with PBS injection group,1)P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,2)P<0.05.

圖2 移植后PD大鼠在Morris水迷宮目標(biāo)象限內(nèi)的停留時(shí)間Fig.2 Retention time of PD rats in Morris water maze target quadrant after transplantationNote:Compared with PBS injection group,*.P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,#.P<0.05.

Groups2 weeks5 weeks8 weeksPBS injection group0.05±0.020.06±0.010.06±0.02BMSCs transplantation group0.16±0.031)0.27±0.051)0.38±0.041)CREB-BMSCstransplantation group0.28±0.021)2)0.49±0.041)2)0.58±0.061)2)F233.53330.24368.57P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with PBS injection group,1)P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,2)P<0.05.

圖3 移植后PD大鼠p-CREB蛋白水平Fig.3 p-CREB protein level in PD rats after transplantationNote: Compared with PBS injection group，*.P<0.05；compared with BMSCs transplantation group，#.P<0.05.

3 討論

PD是一種錐體外系變性疾病，主要因腦黑質(zhì)紋狀體內(nèi)DA合成減少，乙酰膽堿 (acetylcholine，Ach) 興奮作用增強(qiáng)所致[7]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙(如動(dòng)作遲緩、靜止性震顫等)與非運(yùn)動(dòng)障礙(如自主神經(jīng)功能障礙、認(rèn)知功能減退、感覺喪失等)[8]。目前臨床治療PD主要采用手術(shù)干預(yù)治療和藥物替代治療，手術(shù)干預(yù)治療可直接針對(duì)病灶，但手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致PD病情加重[9]。藥物替代治療對(duì)早期病情緩解有一定效果，但長(zhǎng)期服用左旋多巴等藥物易產(chǎn)生藥物依賴性，加重認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)[10]。而具有副作用小、安全等優(yōu)點(diǎn)的基因治療已成為近年來PD治療的研究熱點(diǎn)[11]，可將目的基因修飾的細(xì)胞導(dǎo)入腦內(nèi)干擾蛋白表達(dá)，阻止DA神經(jīng)元變性缺失。

BMSCs是一種來源廣泛的靶細(xì)胞，易增殖、分化且基因易修飾[12,13]，因此本研究從Wistar大鼠兩側(cè)股骨中取BMSCs，將其培養(yǎng)至第三代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、CREB等基因可用于基因治療[14]，其中CREB是Montrminy等[15]發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞核蛋白，廣泛存在于腦內(nèi)各種神經(jīng)元中，可與環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件(cyclic adenosine monophosphate response element，CRE)特異性結(jié)合，其分子結(jié)構(gòu)中含有天冬氨酸(asparagic acid，ASP)區(qū)域、蛋氨酸區(qū)域、激酶誘導(dǎo)區(qū)域(kinase-inducing region，KID)等結(jié)構(gòu)域，其中ASP區(qū)域可與啟動(dòng)子結(jié)合，蛋氨酸區(qū)域可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，KID區(qū)可促進(jìn)CREB發(fā)生磷酸化，p-CREB可保護(hù)損傷神經(jīng)元，而這種保護(hù)作用是通過與CRE結(jié)合后調(diào)節(jié)GDNF、BDNF等因子表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，抑制神經(jīng)元凋亡[3]。同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)形成、神經(jīng)元生長(zhǎng)、突觸可塑性均依賴于CREB功能的正常。另有研究發(fā)現(xiàn)CREB是記憶儲(chǔ)存中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子[16]，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，而學(xué)習(xí)記憶障礙是PD病程的重要表現(xiàn)之一。因此本研究采用CREB基因修飾BMSCs，并將其植入PD大鼠，發(fā)現(xiàn)移植2周、5周、8周后CREB-BMSCs移植組PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯低于BMSCs移植組及PBS注射組，說明CREB-BMSCs植入PD大鼠腦紋狀體后的改善效果明顯優(yōu)于BMSCs移植。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠在Morris水迷宮目標(biāo)象限內(nèi)的停留時(shí)間明顯多于BMSCs移植組及PBS注射組，說明CREB-BMSCs植入PD大鼠腦紋狀體后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較BMSCs移植恢復(fù)的更好。此外Western blot結(jié)果顯示BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白表達(dá)量明顯高于PBS注射組，CREB-BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白表達(dá)量明顯高于BMSCs移植組，提示CREB-BMSCs可明顯促進(jìn)PD大鼠p-CREB水平的提高。

綜上所述，腦紋狀體內(nèi)植入CREB基因修飾的BMSCs可有效改善帕金森大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，由此為帕金森病基因治療提供了新的方向。但這種方法可否應(yīng)用于臨床實(shí)踐仍需進(jìn)一步研究。