MicroRNA-146參與碘誘導(dǎo)NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲狀腺炎①

趙 娜 趙姝潔 李玉姝

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis,AIT)是一種常見的自身免疫性疾病，其中橋本甲狀腺炎(hashimoto thyroiditis,HT)是AIT的主要類型。HT患者主要表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)存在淋巴細胞浸潤和濾泡組織損傷，血清中出現(xiàn)甲狀腺的循環(huán)抗體，主要為抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAbs)和甲狀腺球蛋白抗體(TgAbs)，可導(dǎo)致甲狀腺纖維化或萎縮，并伴有甲狀腺功能減退[1-3]。AIT患者常伴有其他自身免疫性疾病，如1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)等[4]。MicroRNAs(miR NAs)是一類內(nèi)源性單鏈非編碼高度保守的小RNA分子，由22個核苷酸組成，具有多種功能，通過直接結(jié)合特定靶mRNAs的3′非編碼區(qū)(3′UTR)，導(dǎo)致靶mRNAs的降解和/或抑制蛋白質(zhì)翻譯及與lncRNA的相互作用，抑制翻譯起始和起始后蛋白表達[5-9]。miRNAs在免疫系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮重要作用，并參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。AIT的發(fā)病機制尚未明確，有關(guān)miRNAs在AIT中的研究較少，本研究通過探究AIT中miR-146 的水平變化研究AIT的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1材料 34只NOD.H-2h4小鼠購自美國杰克遜實驗室，并在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級別下繁殖和喂養(yǎng)。因其對自身免疫性甲狀腺炎具有遺傳易感性，是AIT理想的小鼠模型[10]。隨機選取4周齡健康雌性小鼠，分為高碘飲水組(High iodine)和正常飲水組(Control)。高碘飲水組為無菌雙蒸水配制的0.05%碘化鈉溶液，相當(dāng)于小鼠正常碘攝入量的1 000倍。將小鼠隨機分為12周對照組(n=6)，12周高碘飲水組(n=10)，20周對照組(n=8)和20周高碘飲水組(n=10)，于實驗開始后第12、20周分別處死小鼠。小RNA 提取試劑盒(RNAiso for small RNA,TaKaRa,日本) ；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(miRcute miRNA First-StrandcDNA Synthesis Kit,Tiangen,北京)；RT-PCR kit試劑盒(Tiangen,北京)。

1.2方法

1.2.1動物處死及組織保存 小鼠麻醉處死后，取新鮮脾臟于PBS中待用。12周小鼠甲狀腺置于4%多聚甲醛中固定HE染色，20周小鼠甲狀腺置RNAlater 4℃過夜后-70℃保存。

1.2.2石蠟切片HE染色 甲狀腺經(jīng)HE染色，光鏡下觀察小鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)等組織學(xué)變化。采用BX51FL+DP70 顯微照相系統(tǒng)，100倍光鏡下，取甲狀腺最大截面，測量整個截面內(nèi)炎癥細胞面積和上皮細胞面積。自身免疫甲狀腺炎的評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：無炎癥細胞浸潤；1分：1%≤浸潤面積<10%；2分：10%≤浸潤面積<30%；3分：30%≤浸潤面積<50%；4分：廣泛浸潤，面積≥50%[11]。

1.2.3免疫磁珠分離脾CD4+T細胞 使用Milteny公司CD4+T細胞分選盒及磁珠，按說明書步驟進行。提取細胞使用臺盼藍染色并計算活細胞數(shù)。部分加入RNAlater于4℃過夜后-70℃保存。

1.2.4miR-146分析 使用小RNA提取試劑盒提取小RNA后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒在miRNA分子末端加poly(A)尾，再用5′ 端帶有延伸序列的Olig-dT引物進行反轉(zhuǎn)得到cDNA，用特異引物和SYBR primecript miRNA RT-PCR kit試劑盒于Light Cycler480實時定量PCR儀進行定量。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行分析。經(jīng)Gene bank驗證，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下游引物為通用引物，以5 s(上游引物：5′-GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC-3′)為參比基因，檢測miR-146(上游引物：5′-GGTGAGAACTGAATTCCATA-GGC-3′)表達量，Lightcycler480軟件計算各目的基因/參比基因的相對定量。

2 結(jié)果

2.1NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎HE染色及炎癥評分 小鼠甲狀腺切片HE染色后進行甲狀腺炎癥評分(圖1)，與Control相比，高碘飲水組小鼠甲狀腺濾泡細胞間淋巴細胞浸潤、濾泡組織增生或破壞，炎癥評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，P<0.05)。本實驗中未發(fā)現(xiàn)炎癥評分達4分小鼠。

2.2miR-146水平在高碘飲水組小鼠脾臟CD4+T細胞和甲狀腺組織中顯著升高 流式細胞儀檢測分選脾臟CD4+T細胞純度(圖3)。與正常飲水組相比，高碘飲水12周AIT小鼠脾CD4+T細胞miR-146水平顯著升高(3.332 0±3.085 0 vs 0.965 0±0.934 7)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A，P<0.05)。高碘飲水20周AIT小鼠甲狀腺組織與正常飲水組相比，miR-146 水平亦顯著升高(0.952 9±0.261 9 vs 0.265 6±0.235 0)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B，P<0.05)。

圖1 NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎癥評分(×200)Fig.1 Thyroid inflammation score in NOD.H-2h4 mice(×200)

圖2 正常飲水組和高碘飲水組小鼠甲狀腺炎癥評分比較Fig.2 Comparison of thyroid inflammation score between control group and high iodine groupNote:*.P<0.05.

圖3 磁珠分選后CD4+T細胞及CD4-T細胞純度鑒定 Fig.3 Purity identification of CD4+T cells and CD4-T cells after magnetic beads separationNote: Flow cytometry was used to detect the ratio of CD4+ T cells (left) and CD4-T cells (right) of the mononuclear cell suspension after separation.

圖4 miR-146水平在高碘飲水組和正常飲水組小鼠脾CD4+ T細胞(A)和甲狀腺組織(B)中的表達Fig.4 Levels of miR-146 in spleen CD4+ T cells (A) and thyroid tissue (B) of mice in high iodine group and control group

圖5 miR-146 在高碘飲水組和正常飲水組小鼠心、肝和腎中的水平Fig.5 Levels of miR-146 in heart,liver and kidney of mice in high iodine group and control group

2.3miR-146水平在正常飲水和高碘飲水組小鼠心、肝和腎中差異 RT-PCR 結(jié)果顯示，在正常飲水組小鼠和高碘飲水12周小鼠心、肝和腎中miRNA-146表達水平近似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5，P>0.05)。

3 討論

NOD.H-2h4小鼠甲狀腺損傷出現(xiàn)于高碘水給予的3～4周[10]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，與正常飲水組相比，高碘飲水12周和20周后，甲狀腺HE切片染色均出現(xiàn)淋巴細胞浸潤。在碘誘導(dǎo)的AIT小鼠中，甲狀腺組織和脾臟CD4+T細胞中miR-146特異性升高。CD4+輔助性T淋巴細胞在調(diào)節(jié)免疫平衡過程中起著重要作用?？乖碳ず螅跏糃D4+T細胞增殖并分化為許多不同的記憶和效應(yīng)細胞群對不同特定病原體做出反應(yīng)，并能遷移到特定組織消除感染。這種效應(yīng)細胞群因分泌不同的細胞因子來定義。包括Th1細胞主要產(chǎn)生高水平IFN-γ，對病毒和細胞內(nèi)細菌做出反應(yīng)。Th2細胞產(chǎn)生高水平的IL-4，主要對細胞外寄生蟲產(chǎn)生反應(yīng)，而Th17細胞則主要產(chǎn)生IL-17，對細胞外細菌和真菌產(chǎn)生反應(yīng)。此外，CD4+T細胞的其他特殊亞群，即T調(diào)節(jié)性(Treg)和T濾泡輔助性(Tfh)細胞，在抑制過度免疫和輔助B細胞反應(yīng)方面具有重要作用[12,13]。近年研究證實，許多miRNAs調(diào)控CD4+T淋巴細胞參與自身免疫性疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythema-tosus，SLE)患者的CD4+T細胞中miR-633水平顯著降低，并與SLE疾病活動指數(shù)評分呈負相關(guān)[14]。Zhao等[15]和Ding等[16]發(fā)現(xiàn)，SLE患者CD4+T細胞中miR-126 和miR-142-3p參與DNA低甲基化和狼瘡T細胞的自身反應(yīng)性。在MS、RA和T1DM等自身免疫性疾病中，也有CD4+T淋巴細胞相關(guān)miRNA異常表達的報道[17-20]。Du等[17]發(fā)現(xiàn)，MS患者miR-326水平在CD4+T細胞中顯著升高，而不是CD8+T細胞或者非T細胞群，Honardoost等[18]亦發(fā)現(xiàn)miR-326在MS復(fù)發(fā)和緩解期之間的差異性表達。同時發(fā)現(xiàn)miR-26a通過靶向TGF-β信號通路(即Smad4和Smad1)參與Th17細胞的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)作用，提示miR-326和miR-26a是診斷復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化患者復(fù)發(fā)和緩解期潛在標(biāo)志物。Jin等[19]使用幼稚CD4+T細胞研究了巨噬細胞炎癥介質(zhì)Maresin 1(MaR1)對其分化過程的影響，并通過microRNA芯片探究Maresin 1下游的microRNA譜。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，非活動性RA患者血清中MaR1濃度較高，活動性RA患者的MaR1濃度較低。并證明miR-21是由MaR1上調(diào)的下游microRNA，通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡改善RA疾病進展。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常飲水組相比，高碘喂養(yǎng)12周AIT小鼠脾CD4+T細胞miR-146水平顯著升高。為了進一步驗證miR-146在自身免疫甲狀腺炎中異常表達，我們又檢測了其在小鼠甲狀腺中的水平，發(fā)現(xiàn)在高碘喂養(yǎng)20周時AIT小鼠甲狀腺組織miR-146水平與正常飲水組相比顯著升高。有關(guān)miR-146在AIT中研究較少，但在RA患者中發(fā)現(xiàn)，成熟miR-146和初始miR-146a/b在RA患者滑膜組織中表達增高，在骨關(guān)節(jié)炎患者和正常的滑膜組織中表達較少[21]。另外，我們發(fā)現(xiàn)正常飲水組和高碘飲水12周小鼠心、肝和腎中miR-146表達水平近似，未有統(tǒng)計學(xué)差異，提示miR-146在AIT小鼠甲狀腺和脾臟CD4+T細胞中特異性升高。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性甲狀腺炎小鼠甲狀腺和CD4+T細胞中miR-146顯著升高，為AIT研究提供新的思路，將進一步闡明AIT的發(fā)病機制。