長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00319通過(guò)LINC00319/let-7a-5p/HMGA2機(jī)制調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的增殖

鮑 紅,陳 波(西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科,西安 710077;通訊作者,E-mail:3354459283@qq.com)

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最致命、最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,根據(jù)其組織病理學(xué)特征及惡性程度分為低分級(jí)膠質(zhì)瘤(WHO Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí))和高分級(jí)膠質(zhì)瘤(WHO Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí))[1,2]。目前膠質(zhì)瘤的治療策略包括手術(shù)、放療和化療,雖然在一定程度上減緩了病情,但是由于膠質(zhì)瘤的高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,患者的預(yù)后仍較差[1]。因此,深入研究膠質(zhì)瘤形成和發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),為制定膠質(zhì)瘤治療策略提供更好理論基礎(chǔ)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本。近年來(lái)的研究表明,lncRNA參與腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和多種腫瘤的耐藥。lncRNA已被證實(shí)在多種人類腫瘤的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用,其可通過(guò)與mRNA、蛋白分子等ncRNAs直接或間接地相互作用,在基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2-5]。目前已經(jīng)鑒定出幾種lncRNA與膠質(zhì)瘤的診斷、進(jìn)展、預(yù)后和治療效果有關(guān)[2-5]。近年來(lái)的研究表明,LINC00319是一種疾病lncRNA,已被證明可調(diào)節(jié)肺癌[6]、鼻咽癌[7]和卵巢癌[8]的進(jìn)展。然而,LINC00319在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及潛在作用尚不清楚。

本研究檢測(cè)lncRNA-LINC00319在膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí)探討LINC00319在膠質(zhì)瘤中的作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 膠質(zhì)瘤組織來(lái)源

選取2015-01～2018-09西電集團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的位于額葉的惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本6例,取同時(shí)期腦外傷手術(shù)中切除的腦組織1例作為對(duì)照組。取切除的膠質(zhì)瘤組織中心位置約0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm大小的組織,立即將組織保存于液氮中,直到提取總RNA。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療,本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求,術(shù)前患者或家屬均簽署研究知情同意書,并經(jīng)西電集團(tuán)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、A172、U87MG、正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(NHA)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞于含有10%胎牛血清(Gibco,美國(guó))和0.1%青鏈霉素(Gibco,美國(guó))的RPMI-1640(Hyclone,美國(guó))培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國(guó)),let-7a-5p Inhibitor及l(fā)et-7a-5p mimics由Generalbiol公司合成,LINC00319干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒(sh-LINC00319及sh-NC)、野生型及突變型LINC00319報(bào)告基因質(zhì)粒(pmirGLO-LINC00319-WT, pmirGLO-LINC00319-MUT)、野生型及突變型HMGA2報(bào)告基因質(zhì)粒(pmirGLO-HMGA2-WT,pmirGLO-HMGA2-MUT)均由西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。TURBO DNA-freeTMKit(Invitrogen,美國(guó)),PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa,日本),SYBR Green PCR Master Mix (TaKaRa,日本),CCK8試劑盒(APExBIO,美國(guó)),Nuclei ez lysis Buffer(Sigma,美國(guó))。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

用Trizol試劑提取總RNA,然后用TurboDNase Kit去除DNA。使用NanoDrop對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量。使用PrimeScript RT試劑盒合成cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix在ABI 7500 Fast real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,以GAPDH水平為對(duì)照,依次檢測(cè)腫瘤和非腫瘤組織、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG、U251、A172)和正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(NHA)、sh-NC(對(duì)照質(zhì)粒)或sh-LINC00319處理后各細(xì)胞系中LINC00319的表達(dá);qRT-PCR法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG、U251、A172)和正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(NHA)中l(wèi)et-7a-5p、HMGA2的表達(dá)情況,同時(shí)檢測(cè)sh-NC(對(duì)照質(zhì)粒)或sh-LINC00319處理、let-7a-5p inhibitor及l(fā)et-7a-5p mimics加入后let-7a-5p和HMGA2的表達(dá)情況。Ct值采用Ct法計(jì)算,基因表達(dá)的相對(duì)變化以2-ΔΔCt法表達(dá),引物見表1。

表1 所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。以5×103個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中,并在不同的轉(zhuǎn)染條件下進(jìn)行處理。在轉(zhuǎn)染后0,24,48,72,96 h,每孔中分別加入CCK-8試劑20 μl,用ELx800(BioTek)于570 nm處測(cè)定每個(gè)樣品的吸光度。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的亞細(xì)胞分離

為了探索LINC00319參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,首先分析了LINC00319在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG、U251和A172細(xì)胞中的分布。利用RNAlocate[9]進(jìn)行查詢,并利用RT-qPCR鑒定LINC00319在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的分布。實(shí)驗(yàn)使用sigma的細(xì)胞核裂解緩沖液分離試劑盒進(jìn)行分離純化細(xì)胞質(zhì)RNA和核RNA,具體參照說(shuō)明書操作。分離的細(xì)胞質(zhì)RNA和核RNA,如1.3步驟所述,采用qRT-PCR檢測(cè)LINC00319在核內(nèi)和胞內(nèi)的表達(dá),分別以U6及GAPDH為參照,引物見表1。

1.6 生物信息學(xué)分析

使用DIANA-LncBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/index.php?r=lncbasev2)和miRDB(http://mirdb.org/)預(yù)測(cè)LINC00319可能結(jié)合的目標(biāo)microRNA,NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)相關(guān)基因信息,miRDB和DIANA-LncBase、TargetScan7(http://www.targetscan.org/vert-71/)被用來(lái)分析預(yù)測(cè)的microRNA的靶點(diǎn)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的microRNAlet-7a-5p與LINC00319的作用。

將U251細(xì)胞接種于96孔板中,接種密度104/孔,第2天將40 nmol/L miR-NC mimics與野生型LINC00319報(bào)告基因質(zhì)粒pmirGLO-LINC00319-WT或突變型LINC00319報(bào)告基因pmirGLO-LINC00319-MUT或?qū)φ召|(zhì)粒pmirGLO分別共轉(zhuǎn)染,另外40 nmol/L let-7a-5p mimics與野生型LINC00319報(bào)告基因質(zhì)粒pmirGLO-LINC00319-WT或突變型LINC00319報(bào)告基因pmirGLO-LINC00319-MUT或?qū)φ召|(zhì)粒pmirGLO分別共轉(zhuǎn)染,每組3個(gè)復(fù)孔,48 h后每孔加入1×Passive溶解緩沖液50 μl,室溫?fù)u床孵育20 min。取30 μl裂解液/孔對(duì)應(yīng)加入Costar白板中,每孔加入100 μl熒光素酶緩沖液,多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔中螢火蟲熒光素酶活性值。再次加入100 μl stop&GLO/孔,多功能酶標(biāo)儀讀取海腎熒光素酶活性值。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

生物信息學(xué)法預(yù)測(cè)let-7a-5p的直接靶基因,采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證let-7a-5p與預(yù)測(cè)基因HMGA2的相互作用。U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC mimics或者let-7a-5p mimics、野生型HMGA2報(bào)告基因質(zhì)粒pmirGLO-HMGA2-WT或突變型HMGA2報(bào)告基因質(zhì)粒pmirGLO-HMGA2-MUT,參照上述步驟,統(tǒng)計(jì)分析熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),三組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00319在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示,LINC00319在晚期病理級(jí)別為Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織和Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中較腦外傷組織表達(dá)升高(P<0.01,見圖1)。與NHA比較,LINC00319在U87MG、U251和A172細(xì)胞中均顯著高表達(dá),并且與對(duì)照相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,見圖1)。

2.2 LINC00319基因下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖

qRT-PCR結(jié)果顯示A172細(xì)胞、U87MG細(xì)胞和U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-LINC00319后,細(xì)胞中LINC00319的表達(dá)均被抑制(P<0.01,見圖2),但在U251和U87MG細(xì)胞中抑制更加明顯。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)在U251和U87MG細(xì)胞中進(jìn)行。

CCK8結(jié)果表顯示,sh-LINC00319可抑制U251和U87MG細(xì)胞增殖(P<0.05,見圖2),提示沉默LINC00319可在體外抑制腫瘤生長(zhǎng)。

2.3 LINC00319直接與let-7a-5p結(jié)合

RT-qPCR結(jié)果顯示LINC00319在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有分布,但細(xì)胞質(zhì)中LINC00319的含量高于細(xì)胞核中LINC00319的含量(P<0.01,見圖3A),因此,LINC00319可能作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮其促癌作用。生物學(xué)預(yù)測(cè)LINC00319潛在靶標(biāo)為let-7a-5p,且let-7a-5p的序列與LINC00319連續(xù)8個(gè)堿基互補(bǔ)(見圖3B)。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與NHA細(xì)胞比較,U87MG、U251和A172細(xì)胞中l(wèi)et-7a-5p均低表達(dá)(P<0.01,圖3C)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,let-7a-5p可以降低pmirGLO-LINC00319-WT的熒光素酶活性,但不能改變pmirGLO-LINC00319-MUT的熒光素酶活性(P<0.05,見圖3D)。

圖1 LINC00319在膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 LINC00319 expression in glioma cancer cells and tissues

圖2 LINC00319基因的下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖Figure 2 Down-regulation of LINC00319 gene inhibited the proliferation of glioma cells

圖3 LINC00319直接與let-7a-5p結(jié)合發(fā)揮功能Figure 3 LINC00319 directly interacts with let-7a-5p

為了進(jìn)一步探討LINC00319是否通過(guò)let-7a-5p發(fā)揮生物學(xué)功能,膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG和U251轉(zhuǎn)染sh-LINC00319、共轉(zhuǎn)染sh-LINC00319及l(fā)et-7a-5p抑制劑,RT-qPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染sh-LINC00319處理組較對(duì)照組let-7a-5p表達(dá)量升高,而let-7a-5p抑制劑的加入可抵消由于LINC00319干擾引起的let-7a-5p高表達(dá)(P<0.01,圖4A),這提示let-7a-5p表達(dá)與sh-LINC00319的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,let-7a-5p抑制劑可減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞中sh-LINC00319的抑制增殖作用(P<0.05,圖4B、C)。

圖4 LINC00319通過(guò)調(diào)控let-7a-5p發(fā)揮作用Figure 4 LINC00319 plays a role in glioma by regulating let-7a-5p

2.4 LINC00319通過(guò)let-7a-5p調(diào)節(jié)HMGA2的表達(dá)

TargetScan、miRDB和DIANA預(yù)測(cè)let-7a-5p的直接靶基因,發(fā)現(xiàn)HMGA2可能是有效的靶基因,熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)let-7a-5p與HMGA2相互作用,結(jié)果顯示,let-7a-5p可以降低pmirGLO-HMGA2-WT的熒光素酶活性,但不能改變pmirGLO-HMGA2-MUT的熒光素酶活性(P<0.05,見圖5A),這表明let-7a-5p可以通過(guò)識(shí)別特定位點(diǎn)直接與HMGA2結(jié)合。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,LINC00319抑制可在mRNA水平上抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG和U251中HMGA2的表達(dá),而let-7a-5p抑制劑可抵消sh-LINC00319對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG和U251中HMGA2的影響(P<0.01,圖5B)。

圖5 LINC00319通過(guò)let-7a-5p調(diào)節(jié)HMGA2的表達(dá)Figure 5 LINC00319 promotes HMGA2 expression by interacting with let-7a-5p

3 討論

基于膠質(zhì)瘤的高復(fù)發(fā)率、低生存率及目前治療的局限性,急切需要能更好地探尋膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制,促進(jìn)膠質(zhì)瘤有效治療策略的發(fā)展[1,10]。近年來(lái)大量研究表明,lncRNA在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中發(fā)揮了重要的功能作用[11,12]。腫瘤組織特異性的lncRNA譜可作為不同癌癥的表型特征,用于癌癥預(yù)后和治療[13]的開發(fā)。近年來(lái),有研究表明,LINC00319可能在腫瘤進(jìn)展中作為一種致癌lncRNA,如Zhou等[6]研究表明LINC00319通過(guò)直接與腫瘤抑制因子miR-32結(jié)合并下調(diào)miR-32,促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲;Zhang等[14]研究表明LINC00319通過(guò)調(diào)控miR-450b-5p/EZH2參與肺腺癌的發(fā)生。在本研究中,RT-qPCR檢測(cè)了6例膠質(zhì)瘤患者LINC00319的表達(dá),結(jié)果顯示LINC00319在膠質(zhì)瘤組織較之對(duì)照組織表達(dá)增加,同時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87MG和A172中LINC00319表達(dá)較NHA細(xì)胞亦顯著增加,而在U251和U87MG細(xì)胞中下調(diào)LINC00319的表達(dá)則抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng),這提示LINC00319可能在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中發(fā)揮作用。

越來(lái)越多的研究表明,lncRNA可以作為ceRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Lu等[15]的研究表明,lncRNA BC032469通過(guò)miR-1207-5p上調(diào)hTERT(human telomerase reverse transcriptase)表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。Fang等[16]認(rèn)為lncRNA HNF1A-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-34a/SIRT1/p53的表達(dá),通過(guò)發(fā)揮ceRNA的作用,促進(jìn)了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。然而,LINC00319在膠質(zhì)瘤中的潛在作用尚不清楚。在本研究中,生物信息學(xué)分析和熒光素酶報(bào)告基因分析的數(shù)據(jù)顯示,let-7a-5p可以通過(guò)識(shí)別特定位點(diǎn)直接與LINC00319結(jié)合,提示let-7a-5p可作為L(zhǎng)INC00319的抑制靶點(diǎn)。另外qRT-PCR結(jié)果顯示,let-7a-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下降,并與LINC00319表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外,在sh-LINC00319轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,let-7a-5p表達(dá)顯著增加。let-7a-5p抑制劑可減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞中sh-LINC00319導(dǎo)致的抑制增殖作用,綜上所述,LINC00319可能通過(guò)調(diào)控let-7a-5p表達(dá)來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

HMGA2是與染色體結(jié)合的非組蛋白,在許多惡性腫瘤中高表達(dá)并與預(yù)后有關(guān)。Li等[17]發(fā)現(xiàn)let-7a可靶向HMGA2并抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移;Palmieri等[18]研究顯示,靶向HMGA基因的miRNA的下調(diào)可能導(dǎo)致人垂體腺瘤HMGA蛋白水平升高,進(jìn)而導(dǎo)致垂體腫瘤的發(fā)生。Gao等[19]研究表明HMGA2在miR-195的調(diào)控下對(duì)肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要作用。然而lncRNA和HMGA2在膠質(zhì)瘤中的相互作用尚不清楚。本研究中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示HMGA2可能是let-7a-5p有效的靶基因,與NHA細(xì)胞比較,HMGA2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87MG中高表達(dá),而抑制LINC00319可抑制HMGA2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87MG中的表達(dá),同時(shí)let-7a-5p抑制劑可抵消因LINC00319抑制導(dǎo)致的HMGA2表達(dá)減少。這些結(jié)果表明,神經(jīng)膠質(zhì)瘤中LINC00319可能通過(guò)let-7a-5p調(diào)控HMGA2的表達(dá)。

總之,本研究表明,LINC00319通過(guò)let-7a-5p的功能促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖,并提示在膠質(zhì)瘤中存在一種新的LINC00319-let-7a-5p-HMGA2信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果提示,LINC00319有可能成為膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。但本文的臨床組織標(biāo)本量偏少,在后續(xù)的研究中,我們一方面將繼續(xù)擴(kuò)大標(biāo)本量,為L(zhǎng)INC00319-let-7a-5p-HMGA2作為膠質(zhì)瘤標(biāo)志物提供更加可靠的理論依據(jù);另一方面,將從體外細(xì)胞分子水平及和體內(nèi)裸鼠水平,進(jìn)一步探討LINC00319-let-7a-5p-HMGA2在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。