骨髓間充質(zhì)干細胞對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷的抑制作用及其機制

蔣 勵,許 耀,王世龍,湯超亮,陳文鈞(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院骨科,上海 200040)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)腔炎癥為主要病理變化的慢性關(guān)節(jié)退變疾病,會使患者活動受限,并帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[1-3]。目前OA的治療方法主要包括減少負重、服用非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物等,但減少負重并不適合所有病人,因此尋找一種更為有效的治療方法迫在眉睫[4]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作為組織工程學(xué)的研究熱點,為OA的治療提供了新的思路。MSCs具有易獲取、培養(yǎng)簡單、增殖速度快及免疫耐受等特點,因此已逐漸用于多種疾病的治療當中。研究也已經(jīng)證實MSCs能夠定向分為軟骨細胞,而且對損傷軟骨具有修復(fù)作用[5,6],但具體作用機制尚不明確。本研究將以白介素1-β(IL-1β)誘導(dǎo)軟骨細胞模擬體外OA模型,探討MSCs對OA的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性SPF級別的SD大鼠10只,體質(zhì)量約100 g,購于上海斯萊克實驗動物有限公司,合格證號SCXK(滬2012-0002),大鼠在(25±2)℃環(huán)境下于鼠籠中自由活動并飲食。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；重組人白介素-1β(IL-1β)、兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bax)、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-13、核因子-κB(NF-κB)、p-NF-κB、核因子-κB抑制蛋白(IκBα)、p-IκBα及GAPDH多克隆抗體購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購于碧云天生物技術(shù)有限公司。Epics-XLⅡ流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；MK3酶標儀購自美國thermo公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 大鼠軟骨細胞的制備

將大鼠脫頸處死，無菌分離大鼠膝關(guān)節(jié)，剝離軟骨面的結(jié)締組織，取透明軟骨，用PBS洗滌，將組織剪為1 mm3的小塊。0.25%胰蛋白酶37 ℃預(yù)消化30 min，棄清液，加0.2%Ⅱ型膠原酶37 ℃消化4 h，200目濾網(wǎng)過濾，2 000 r/min離心10 min，收集細胞[7,8]。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8-10 d，當軟骨細胞密度達到80%-90%時，傳代，取第3代軟骨細胞進行試驗。

1.4 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定

將大鼠脫頸處死,用75%酒精消毒,PBS沖洗干凈,取大鼠右側(cè)脛骨及股骨,去除骨端,暴露骨髓腔,用DMEM/F12培養(yǎng)基充分沖洗骨髓腔并收集骨髓,1 500 r/min離心10 min,收集細胞并重懸。于含有15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),每隔3 d換液,去除未貼壁細胞,在細胞融合程度80%時,以1∶3傳代,第3代細胞用于后續(xù)實驗。光鏡觀察細胞生長形態(tài),用流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標志物,當細胞表面標志物CD90陽性率高于95%,CD34及CD45陽性率均低于5%時,即獲得純度高、均一性較好的BMSCs,用于后續(xù)實驗[9,10]。

1.5 細胞分組

將軟骨細胞分為正常對照組(無任何干預(yù))、IL-1β組(10 ng/ml IL-1β)和BMSCs組(軟骨細胞與BMSCs細胞共培養(yǎng)的同時加10 ng/ml IL-1β)。

1.6 CCK-8法檢測細胞活力

將軟骨細胞接種于96孔板,待細胞貼壁后,按1.5分組處理細胞,培養(yǎng)48 h,加入CCK-8試劑孵育4 h,于酶標儀560 nm處測定細胞吸光值(OD值)。

1.7 RT-PCR法檢測細胞中Aggrecan及ColⅡ mRNA表達

按照Trizol試劑盒說明書提取細胞中總RNA，并測定RNA濃度及純度，當RNA純度(OD260 nm/OD280 nm)為1.8時，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，基于SYBR Green Ⅰ熒光分析的real time PCR檢測，預(yù)變性95 ℃，15 min；變性95 ℃，20 s；退火60 ℃，34 s；40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法統(tǒng)計Aggrecan及ColⅡ mRNA的表達量，以GAPDH為內(nèi)參。引物見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測蛋白表達量

收集細胞并裂解，獲得細胞總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取30 ng蛋白樣品，12% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的BSA室溫下孵育1 h，加一抗(兔抗Bcl-2、Bax,MMP-1,MMP-13,NF-κB,p-NF-κB,IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶1 000)4 ℃過夜孵育，室溫孵育二抗[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋度為1∶500]，根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒說明書在凝膠成像系統(tǒng)中曝光蛋白條帶，分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞活力的影響

與正常對照組比較,IL-1β組細胞活力降低(P<0.01);與IL-1β組比較,BMSCs組活力提高(P<0.01,見表2)。

2.2 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中Aggrecan及ColⅡ mRNA表達量的影響

與正常對照組比較，IL-1β組Aggreca mRNA表達量均顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，BMSCs組Aggrecan及ColⅡmRNA表達量均顯著提高(P<0.01，見表2)。

表2 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞活力及Aggrecan、ColⅡ mRNA表達量的影響Table 2 Effect of BMSCs on the viability and the expression of Aggrecan, ColⅡ mRNA in chondrocytes induced by IL-1β

與正常對照組比較,**P<0.01;與IL-1β組比較,##P<0.01

2.3 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中Bcl-2、Bax、MMP-1和MMP-13蛋白表達量的影響

與正常對照組比較,IL-1β組Bcl-2表達量下調(diào)(P<0.01),Bax、MMP-1、MMP-13蛋白表達量均顯著上調(diào)(P<0.01);與IL-1β組比較,BMSCs組Bcl-2表達量上調(diào)(P<0.01),Bax、MMP-1、MMP-13蛋白表達量均顯著下調(diào)(P<0.01,見圖1、表3)。

圖1 Western blot檢測BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中Bcl-2、Bax、MMP-1和MMP-13蛋白表達量的影響Figure 1 Effect of BMSCs on the expression of Bcl-2, Bax, MMP-1 and MMP-13 in chondrocytes induced by IL-1β by Western blot

表3 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中Bcl-2、Bax、MMP-1和MMP-13蛋白表達量的影響Table 3 Effect of BMSCs on the expression of Bcl-2, Bax, MMP-1 and MMP-13 in chondrocytes induced by IL-1β

與正常對照組比較,**P<0.01;與IL-1β組比較,##P<0.01

2.4 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量的影響

與正常對照組比較,IL-1β組p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量均顯著上調(diào)(P<0.01);與IL-1β組比較,BMSCs組p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量均顯著下調(diào)(P<0.01,見圖2、表4)。

圖2 Western blot檢測BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量的影響Figure 2 Effect of BMSCs on the expression of p-NF-κB and p-IκBα in chondrocytes induced by IL-1β by Western blot

表4 BMSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量的影響Table 4 Effect of BMSCs on the expression of p-NF-κB and p-IκBα in chondrocytes induced by IL-1β

與正常對照組比較,**P<0.01;與IL-1β組比較,##P<0.01

3 討論

BMSCs是一種從包括骨髓、脂肪、滑膜、肌肉等組織中分離培養(yǎng)獲得的干細胞,培養(yǎng)方法簡單、易于分離、純化,而且有多種分化潛能,在不同的誘導(dǎo)條件下可定向分化未軟骨細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞等,為組織的修復(fù)和再生提供新的治療方法。目前研究發(fā)現(xiàn),BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng),能顯著地促進細胞的增殖與分化,但其作用機制尚不明確。

軟骨細胞增殖和細胞外基質(zhì)的合成是生理條件下關(guān)節(jié)軟骨的基本特征。蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型膠原蛋白(ColⅡ)是細胞外基質(zhì)的基本成分，二者的表達水平能很好地體現(xiàn)軟骨細胞外基質(zhì)的合成情況[11],12]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細胞外基質(zhì)成分的主要水解酶，在骨骼發(fā)育、骨重建過程中起重要作用。MMP-1和MMP-13能夠水解軟骨組織中的Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖，能水解Ⅳ、Ⅸ膠原蛋白，因此在OA的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

本研究采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞模擬體外OA模型，使用BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)，探討B(tài)MSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷的影響，結(jié)果表明BMSCs能顯著地提高軟骨細胞活力，上調(diào)aggrecan、ColⅡ mRNA表達，并下調(diào)MMP-1、MMP-13表達，提示BMSCs通過促進軟骨細胞外基質(zhì)合成和抑制細胞外基質(zhì)降解，緩解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞中的與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,含p50、p52、p65、RelB及c-Rel等5個亞基,其中p50/60常被稱為NF-κB。NF-κB在靜息狀態(tài)下,與上游IκB蛋白形成三聚體,在TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子刺激下,IκB蛋白從三聚體解離,使p50及p65暴露,其中p65由細胞漿進入細胞核,與DNA增強子特異性位點結(jié)合,進而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄,影響細胞的增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)行為。Bcl-2家族是最常見的細胞凋亡調(diào)控家族,其中Bcl-2是研究最為廣泛的抗凋亡蛋白,能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體,阻斷凋亡信號傳遞給Caspase家族,促進細胞存活與生長。Bax能自身形成二聚體,傳遞凋亡信號,誘導(dǎo)細胞凋亡。研究顯示,NF-κB信號通路在OA發(fā)生發(fā)展過程中被高度激活,且阻斷NF-κB信號通路已成為OA治療的手段之一[13-15]。本研究探討B(tài)MSCs對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達的影響,結(jié)果表明BMSCs能顯著地上調(diào)Bcl-2表達,下調(diào)p-NF-κB、p-IκBα、Bax表達,從而抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥反應(yīng)及細胞凋亡。

綜上所述,BMSCs能顯著地提高IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞活力,促進細胞外基質(zhì)成分的合成,抑制其降解,與上調(diào)aggrecan、ColⅡ mRNA表達,下調(diào)MMP-1、MMP-13表達有關(guān)。而且BMSCs也能顯著地抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥反應(yīng)及細胞凋亡,與上調(diào)Bcl-2表達和下調(diào)p-NF-κB、p-IκBα、Bax表達有關(guān)。