鬼針草提取物對高脂高糖模型小鼠的影響

2

1.遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院臨床護理教研室，廣東 珠海 519100；2.遵義醫(yī)科大學藥理學教研室暨貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)生物工程系,廣東 珠海 519041

目前，心腦血管疾病已經成為全球人類死亡的首要原因[1-2]。高血糖、高血壓、高血脂在醫(yī)學界俗稱“三高”，三者之間可以單獨存在，也可相互依存[3]。目前這些疾病的治療通常采用單獨用藥的方法，即分別對高血壓、高血脂、高血糖進行治療，這樣既增加了藥物使用的種類，也相應增加了藥物的服藥量和不良反應[4]。

臨床上用于治療高血脂的藥物根據其降低血脂的功能可以分為他汀類、貝特類、煙酸類、膽酸螯合劑、膽固醇吸收抑制劑等五大類，具體藥物有煙酸、氯貝特、普羅布考等[5]。目前普遍用于臨床的口服降糖藥,按其降糖作用的機制不同,大體分為4類:磺脲類(SU),雙胍類,α葡萄糖苷酶抑制劑和胰島素增效劑。單味中藥具有降血糖作用的有黃芪、黃精、地黃、人參、鬼箭羽、麥冬等[6]。文獻研究證實了多種中草藥都具有降低血糖、血脂的作用，而且毒副作用也比較少[7]。鬼針草(BidensbipinnataL.)為菊科一年生草本植物，在我國大部分地區(qū)均有廣泛分布，而且它的生長周期比較短，對生態(tài)環(huán)境要求也并不嚴格，非常容易采集，是一種相對理想的和具有廣闊開發(fā)應用前景的天然藥物[8]。據記載鬼針草具有清熱解毒、散瘀消腫的功效[9-10]。常用的鬼針草藥材為鬼針草的干燥全草，在我國民間治療糖尿病方面的應用十分廣泛。

本課題在研究前期中經查文獻得知鬼針草總黃酮(TFB)為其有效成分[11]，經過相關動物實驗的研究結果得知鬼針草總黃酮(TFB)具有顯著降低小鼠血糖的作用[12-13]，但針對鬼針草治療高脂血癥合并高血糖的研究少見。本次研究就鬼針草醇提物對小鼠高脂血癥合并高血糖的影響進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品 昆明種小白鼠70只(SPF級，20～25 g，選取日齡約42～56d)，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供[實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002]。

血清總膽固醇、甘油三酯、高密度膽固醇、低密度膽固醇試劑盒(南京建成生物，產品批號：20181022)，二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司)，膽固醇(安徽天啟化工科技有限公司，產品批號：20180521)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 鬼針草總黃酮的提取 材料鬼針草采集于廣東珠海三灶鎮(zhèn)，由遵義醫(yī)科大學藥學陳陽教授鑒定。將已烘干的鬼針草全草2 kg放入粉碎機粉碎至粉末狀，所得藥粉放入玻璃灌中并加入六倍體積50%乙醇溶液，超聲提取3次，每次50 min。將超聲好的藥液過濾，將濾液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮并真空干燥至稠膏狀備用[14-15]，得鬼針草總黃酮12 g。

1.2.2 高脂乳劑的制備 油相的制備：稱取豬油30 g置于燒杯中，將燒杯置于磁力恒溫攪拌器并一直攪拌的同時加熱到100℃后將膽固醇10 g緩慢加入，待溶化后再向其中加入1 g丙賽優(yōu)，繼續(xù)向燒杯中加入20 mL吐溫80并攪拌均勻。

水相的制備：取1個干凈燒杯加入20 mL丙二醇和30 mL蒸餾水，用磁力恒溫攪拌器加熱直至60℃的時候向其中加入2 g脫氧膽酸鈉，將其攪拌至完全均勻便得水相。將水相與于油相震蕩至均勻混合制得高脂肪乳劑，將制得的高脂肪乳劑裝在密閉的燒杯中放入4 ℃冰箱保存[16]。

1.2.3 高脂血癥合并高血糖小鼠模型的建立 實驗用70只小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，70只小鼠隨機分為正常組10只和模型組60只，兩個組都用普通飼料喂養(yǎng)。模型組每天下午給予高脂乳劑0.01 mol/g灌胃的同時一次性腹腔注射1%四氧嘧啶150 mg/kg(四氧嘧啶溶于0.1 mol/L,pH4～5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用)[17]。正常組則灌胃同體積飲用水和腹腔注射相同量緩沖液。連續(xù)灌胃高脂乳劑30 d時、兩組動物分別少量多次斷尾取血和毛細管眼眶采血，測得模型組血糖≥14.5 mol·L﹣1，血清TC、TG、LDL-C明顯增高，HDL-C明顯降低，說明造模成功。

1.2.4 實驗分組與給藥 造模成功后從模型組選出50只造模成功的小鼠，隨機分為模型組，鬼針草總黃酮高濃度組(160 mg/kg)、中濃度組(80 mg/kg)、低濃度組(40 mg/kg)，二甲雙胍+脂必妥(150 mg/kg+135 mg/kg)組，每組10只。每天按相應劑量灌胃給藥，正常組和模型組灌胃同量飲用水。連續(xù)給藥4周。在最后一次給藥后，禁食但是不禁水12 h。

1.2.5 樣品收集與指標檢測 處死小鼠并斷頭取血收集裝于有肝素鈉的EP管內并用血糖儀測定各組小鼠血糖水平。

小鼠血樣4℃保存，離心(3000 rpm/10 min)，取上清液，采用TC、TG、HDL-C、LDL-C的相關試劑盒按說明書操作檢測相應指標。取肝組織做HE染色。

1.2.6 病理組織學檢查 將取得的小鼠肝組織用10 %甲醛固定9～10 h后取出切取組織(組織長約1～1.5 cm,厚約為0.2～0.3 cm)放入塑料筐切面朝下，全自動脫水機脫水12 h。石蠟浸蠟包埋、定形后切片。HE 染色基本步驟，烤片20 min后進行如下操作。

脫蠟：①二甲苯10 min(兩次)；②無水乙醇3 min(兩次)；③95%乙醇3 min，90 %乙醇3 min，80 %乙醇3 min,70 %乙醇3 min；④自來水洗1 min；

染色：①浸入蘇木素染液浸染6 min左右；②自來水洗1 min；③1%鹽酸乙醇分化2～3 s，流水沖洗5 min；④伊紅染色25～30 s；⑤自來水洗1 min；

脫水透明和封固：①70 %乙醇3～5sec；80 %乙醇3～5 s；90 %乙醇3～5 s；95 %乙醇3～5 s(兩次)；②無水乙醇2～3 s(兩次)；③中性樹膠封片。

切片形態(tài)學觀察及采圖。

2 結果

2.1 鬼針草醇提物對高血糖小鼠血糖的影響 與正常組相比，模型組小鼠血糖明顯升高(P<0.01)，表明高血糖模型造模成功。與給藥前相比、給藥后TFB高、中、低濃度及陽性組小鼠血糖水平均顯著下降(P<0.01)。與模型組比較TFB高、中、低濃度及陽性組小鼠血糖水平均下降(P<0.01或P<0.05)。提示 TFB高、中、低濃度具有顯著的降低血糖作用。見表1。

2.2 各組小鼠給藥前后血脂的比較 與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C顯著升高(P<0.01)，HDL-C顯著降低(P<0.01)，表明高脂血癥模型造模成功。與模型組比較，TFB(200、150、100 mg/kg)組能顯著降低高脂血癥小鼠 TC、TG(P<0.01)，升高 HDL-C(P<0.01或P<0.05)并降低LDL-C(P<0.01)。提示 TFB 具有顯著的降低血脂作用。見表2。

表1 各組小鼠給藥前后血糖水平的比較

注:與正常組相比,aaP<0.01；與給藥前相比,bbP<0.01；與模型組比較,ccP<0.01，cP<0.05。

表2 各組小鼠給藥前后血脂水平的比較

注：與正常組比較，aaP<0.01；與模型組比較bP<0.05，bbP<0.01。

2.3 TFB對高脂血癥小鼠肝組織病理學的影響 由圖4可知，各組小鼠的肝組織經過HE染色后,在同倍數(shù)光學顯微鏡下觀察可知,正常對照組小鼠的肝細胞排列整齊，呈現(xiàn)放射狀，可以看見正常的細胞核結構(圖4A)。高糖高脂模型組小鼠的肝細胞胞膜分界不清楚，可以見細胞質中出現(xiàn)脂肪空泡，部分細胞顯現(xiàn)出脂肪變性腫大，細胞核偏離了正常的位置(圖4B)。與模型組比較，TFB(200 mg/kg、150 mg/kg、100 mg/kg)給藥組(圖4D、E、F)和陽性組(圖4C)可以看見小鼠的肝細胞脂肪空泡明顯減少，在同樣倍數(shù)鏡檢下顯示，肝細胞體積有變小，細胞核位置基本處于正常狀態(tài)。

3 討論

高脂血癥是我國老年人群中很常見的慢性疾病、是導致動脈粥樣硬化的危險因素之一，它已經成為我國現(xiàn)目前不可忽視的社會公共衛(wèi)生問題[18-19]。為研究TFB對高血糖合并高脂血癥的影響，本實驗采用健康SPF級小鼠作為實驗動物，并以同系品小鼠作為正常對照組。通過高脂乳劑灌胃的同時一次性腹腔注射四氧嘧啶建立高脂高糖模型。

實驗數(shù)據顯示：鬼針草總黃酮按高、中、低3個劑量分別灌胃給藥后，與模型組相比較，血糖水平顯著性下降(P<0.01或P<0.05)。與給藥前相比給藥后都顯著性下降(P<0.01)。提示鬼針草醇提物高、中、低濃度都具有顯著的降低血糖的作用。

肝臟是合成和貯存血清總膽固醇(TC)的主要器官，甘油三酯(TG)又稱中性脂肪[20]。在臨床上根據TC和TG的量、對高脂血癥進行分型，以TC升高為主的、定義為膽固醇型高脂血癥，以TG升高為主的、定義為甘油三酯型高脂血癥，如兩者都升高的則為混合型高脂血癥[21-22]。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)主要由肝臟合成，具有防止動脈粥樣硬化的危險，有研究表明HDL-C水平與冠心病呈負相關[23]，TC、TG、LDL-C濃度與心腦血管的疾病發(fā)生呈正相關[24]。

在本次研究中，鬼針草醇提物按高、中、低三個劑量分別于灌胃后，與模型組比較TC、TG及LDL-C顯著性降低(P<0.01)。HDL-C顯著性升高(P<0.01或P<0.05)。提示鬼針草醇提物具有顯著降低小鼠血脂的作用。

根據肝組織病理切片HE染色的結果顯示：模型組小鼠肝細胞與正常組小鼠肝細胞相比較，模型組小鼠肝細胞出現(xiàn)脂肪空泡，細胞核的位置也偏離正常的位置。TFB(200、150、100 mg/kg)給藥組和陽性組與模型組小鼠肝細胞的脂肪變化程度相比，脂肪空泡明顯減少，細胞體積變小、胞核基本處在正常位置處，表明TFB對小鼠肝組織的脂肪變性具有較明顯的改善作用。