貓爪草納米乳噴霧劑的制備及對(duì)慢性咽炎大鼠模型的影響研究

曾春姣1 陳玲瓏2 劉 婷1 李躍輝3

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411000；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下及淋巴組織的彌漫性炎癥，常為上呼吸道慢性炎癥的一部分[1]。該病多見于成年人，癥狀頑固，病程長(zhǎng)，不易治愈[2]。近年來，該病的發(fā)病率持續(xù)上升，患者主要表現(xiàn)為咽腔發(fā)癢、干燥、刺激性咳嗽等臨床癥狀，導(dǎo)致患者食欲減退、睡眠不佳、失眠等后果，給人們的身心健康造成了嚴(yán)重危害。目前臨床對(duì)于該病的治療手段，西醫(yī)常以化學(xué)藥物為主，如抗生素、組胺和糖皮質(zhì)激素等，但這些藥物多具一定的毒副作用，且僅對(duì)癥治療，療效欠佳，對(duì)于病因復(fù)雜的慢性咽炎的治療往往是治標(biāo)不治本。中醫(yī)對(duì)于慢性咽炎的治療毒副作用小，善于從多途徑入手治療，治愈率一般較好，且病情不易反復(fù)，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。而從現(xiàn)階段看來，治療慢性咽炎的中藥單方或復(fù)方內(nèi)服制劑均已取得了較好的成績(jī)，而治療此類疾病效優(yōu)的外用制劑仍比較缺乏。

貓爪草Ranunculi Ternati Radix屬于我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展的三類藥材之一，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳祛痰等功效[3-4]，臨床用于治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、咽喉炎、腫瘤、瘧疾等癥[5-6]?，F(xiàn)代研究[7]表明，貓爪草主要含有黃酮類、苷類、揮發(fā)油、有機(jī)酸等，其中黃酮類成分含量豐富，且具有鎮(zhèn)咳、祛痰、消炎作用。目前，臨床上常用的貓爪草的制劑主要以顆粒劑和水煎湯劑為主，由于咽喉黏膜的特點(diǎn)為穿透性較高且酶相對(duì)較少，但藥物滯留時(shí)間短，為了延長(zhǎng)貓爪草在咽喉黏膜的滯留時(shí)間，提高其生物利用度，將其開發(fā)成使用便利、效果上佳的納米乳噴霧劑來彌補(bǔ)其內(nèi)服制劑的缺陷[8-9]，對(duì)治療慢性咽炎十分有益。迄今為止有關(guān)貓爪草的外用劑型仍鮮有研究，其納米乳噴霧劑劑型亦涉及較少。該項(xiàng)目已成功通過正交試驗(yàn)法優(yōu)選了貓爪草總黃酮的最佳醇提工藝，為促進(jìn)貓爪草藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用，本文中擬利用偽三元相圖制備出貓爪草納米乳噴霧，并初步觀察了貓爪草納米乳噴霧對(duì)慢性咽炎大鼠模型的影響，以期為該制劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試劑與樣品 貓爪草藥材(昌都振興中藥飲片實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)18053002)、貓爪草提取物(自制，批號(hào)：20181126)；聚氧乙烯醚氫化蓖麻油(RH40)(批號(hào)：20170613)、山梨醇酐油酸酯-80(司盤80)(批號(hào)：20170911)、聚山梨酯-80(吐溫80)(批號(hào)：20170809)、肉豆蔻酸異丙酯(IPM)(批號(hào)：20170718)、油酸乙酯(批號(hào)：20170820)、蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)(批號(hào)：20170824)、液體石蠟(批號(hào)：20170911)、卵磷脂(批號(hào)：20170628)均購自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；丙三醇(批號(hào)：000120170104)、丙二醇、和1，3-丁二醇均購自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司、貓爪草納米乳噴霧劑(湖南省中醫(yī)藥研究院制劑室提供，批號(hào)20190325)、復(fù)方一枝黃花噴霧劑(貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司，批號(hào)20180415，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025898)。

1.2 儀器 YP5102型電子天平(上海光正醫(yī)療有限公司)；78HW-1型恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠)；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SKP02.420型電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司)；BCD-208K型冰箱(青島海爾股份有限公司)；JEM-1230型電子顯微鏡(日本電子公司)；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；UV-2450型紫外分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；ZEN3690 粒子檢測(cè)儀(馬爾文儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-多儀器有限公司)；病理圖像分析儀(OLYMPUSDP71，奧林巴斯映像銷售有限公司)；HX2002T電子天平(慈溪市天東衡器廠)；LEICABM2135型石蠟切片機(jī)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，體重180～200 g，雌雄各半，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于SPF級(jí)屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，室溫20～25℃，相對(duì)濕度55%～75%，12 h光照晝夜循環(huán)。

2 方法與結(jié)果

2.1 貓爪草納米乳的制備工藝研究

2.1.1 貓爪草提取物的制備 以總黃酮提取量和浸膏得率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選的貓爪草的提取工藝。按照已確定的工藝制備貓爪草提取物：在60°C的溫度條件下，稱取適量貓爪草粗粉加乙醇回流提取2次，第1次加8倍量75%乙醇提取1.5 h，第2次加7倍量75%乙醇提取1 h；合并兩次提取液過濾，在溫度為60～70℃和真空度為-0.08Mpa的條件減壓濃縮干燥得貓爪草提取物。

2.1.2 溶解度試驗(yàn) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，比較貓爪草提取物在不同油相(IPM、油酸乙酯、液體石蠟、卵磷脂)、乳化劑(Tween-80、RH40、EL-40、Span-80)和助乳化劑(正丁醇、丙三醇、1，2-丙二醇、無水乙醇)中的溶解度。取上述12種輔料各2 mL分別置于具塞離心管中，每根離心管分別加入足量的貓爪草提取物，密封后置于渦旋混合器上渦旋20 min，使藥物充分溶解，然后將混合物于3000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，吸取上清液1 mL，用甲醇稀釋至50 mL，再吸取甲醇液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加水3 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加NaOH試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0401)，測(cè)定吸光度在500 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算貓爪草提取物的不同輔料中的溶解度。結(jié)果見表1。

表1 貓爪草提取物在不同溶媒中的溶解度

為使制劑對(duì)藥物有最大的增溶能力，必須選擇對(duì)藥物溶解度較大的油相、乳化劑和助乳化劑。由表1可知，貓爪草提取物在油相(IPM、油酸乙酯、卵磷脂)、乳化劑(EL-40、Span-80、RH40)和助乳化劑(丙三醇、無水乙醇)中溶解度較高；在助乳化劑中，貓爪草提取物在丙三醇的溶解度最大，且丙三醇的副作用少。故初步確定IPM、油酸乙酯、卵磷脂為納米乳的備選油相；EL-40、Span-80、RH40為納米乳的備選乳化劑，助乳化劑為丙三醇。

2.1.3 油相的確定 由上步溶解度試驗(yàn)確定丙三醇為本品納米乳處方中的助乳化劑，將乳化劑(EL-40)和助乳化劑(丙三醇)按3∶1的質(zhì)量比(Km)均勻混合成混合乳化劑，然后將混合乳化劑與油相(IPM、油酸乙酯和卵磷脂)按質(zhì)量比 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例分別混合，在磁力攪拌下，緩慢加入蒸餾水滴定，直至溶液呈穩(wěn)定透明，記錄體系變化時(shí)各相滴定終點(diǎn)的用量。采用Origin8.0軟件，分別以水相、油相及混合乳化劑為3個(gè)頂點(diǎn)， 繪制偽三元相圖，通過偽三元相圖形成納米乳面積區(qū)域的大小的方法來確定油相，結(jié)果見圖1。

圖1為Km為3∶1時(shí)，3種不同油相的偽三元相圖，由此可見以IPM為油相時(shí)，形成的納米乳面積最大，確定IPM作為本處方中納米乳的油相。結(jié)合溶解度試驗(yàn)結(jié)果，選定油相為IPM，助乳化劑為丙三醇，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4乳化劑的確定 將3種乳化劑(EL-40、Span-80、RH40)與助乳化劑(丙三醇)按3∶1的質(zhì)量比(Km)均勻混合成混合乳化劑，再與油相(IPM)按質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例分別混合，按“2.2.3”項(xiàng)下繪制偽三元相圖，結(jié)果見圖2。

圖2為Km為3∶1時(shí)，3種不同乳化劑的偽三元相圖，由此可見以EL-40為乳化劑時(shí)，形成的納米乳面積最大，確定EL-40作為本處方中納米乳的乳化劑。因此確定本處方中納米乳的組成為：IPM(油相)-EL-40(乳化劑)-丙三醇(助乳化劑)。

2.1.5 Km值的確定為進(jìn)一步優(yōu)化納米乳的處方體系，考察不同Km對(duì)納米乳化區(qū)域的影響，繼續(xù)使用水滴定法繪制偽三元相圖的辦法確定最佳的納米乳處方，將EL-40(乳化劑)與丙三醇(助乳化劑)按質(zhì)量比(Km)為2∶1、3∶1、4∶1混合作為混合乳化劑，再與IPM(油相)按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例分別混合，按“2.2.3”項(xiàng)下繪制偽三元相圖，結(jié)果見圖3。

由偽三元圖可知，當(dāng)乳化劑和組乳化劑的質(zhì)量比(Km)為3∶1時(shí)，形成的納米乳區(qū)域最大，因此最終選擇Km值為3∶1的納米乳體系。

2.1.6 貓爪草納米乳的制備 以IPM為油相，EL-40為乳化劑，丙三醇為助乳化劑，從Km值為3∶1的偽三元相圖中選擇處方，油相-乳化劑-助乳化劑=10∶21∶7∶60，精密稱取除水以外的輔料，再精密稱取貓爪草提取物適量加入上述輔料，37 ℃恒溫水浴磁力攪拌使貓爪草提取物完全溶解，在攪拌下滴加處方量的水相，即得澄清透明貓爪草提取物納米乳，裝入冷噴壺即得貓爪草納米乳噴霧劑。

2.1.7 貓爪草納米乳粒徑的測(cè)定 取貓爪草納米乳5 mL，使用激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。以聚苯乙烯球形小珠士作為外標(biāo)、光散射測(cè)定角度為90°進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，貓爪草納米乳的平均粒徑為(84±3.12)nm，PDI為0.106。結(jié)果見圖4。

2.1.8 貓爪草納米乳穩(wěn)定性研究 采用恒溫加速試驗(yàn)考察，取貓爪草納米乳于-5、25、45、65 ℃及相對(duì)濕度在75%的條件下保存，分別于5 d、10 d后，取樣觀察其外觀；取貓爪草納米乳于離心管中，10000 r/min離心25 min，考察其外觀，結(jié)果如表2。

表2 貓爪草納米乳穩(wěn)定性考察結(jié)果

從上述試驗(yàn)結(jié)果可得知，貓爪草納米乳在不同的環(huán)境中均能得到澄清透明的液體，表明貓爪草納米乳穩(wěn)定性良好。

2.2 貓爪草納米乳對(duì)慢性咽炎大鼠模型的影響

2.2.1 造模及分組[10]取SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分空白組、模型組、陽性對(duì)照組(復(fù)方一枝黃花噴霧劑)、貓爪草高劑量組、貓爪草中劑量組、貓爪草低劑量組，共6組，每組10只。以苦味酸標(biāo)記，并記錄每只大鼠的重量，各組大鼠均用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。陽性對(duì)照組、貓爪草高劑量組、貓爪草中劑量組、貓爪草低劑量組，上、下午各用2.5%氨水噴其咽部1次，每次用噴霧器噴3撳，連續(xù)15 d；空白組同法予蒸餾水噴咽部，連續(xù)15 d。每日觀察大鼠的納食、活動(dòng)量、飲水量、口腔分泌物及有無搔抓口咽部動(dòng)作等，并每日觀察大鼠咽部1次。模型組于第16天用10%水合氯醛麻醉后，處死動(dòng)物，分離咽部組織以供作病理切片觀察。造模完成后，連續(xù)5 d參照李儀奎《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的人與動(dòng)物劑量換算方法，陽性對(duì)照組每天按0.25 g/kg劑量給藥；貓爪草高劑量組、貓爪草中劑量組、貓爪草低劑量組每天劑量按0.6 g/kg、0.3 g/kg、0.15 g/kg給藥；空白組予同體積蒸餾水。

2.2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 處死大鼠，分離咽部組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，作常規(guī)石蠟切片，HE 染色，中性樹脂封片，并于光鏡下觀察各 組大鼠咽組織病理變化，并進(jìn)行病理評(píng)分[11]：觀察標(biāo)本是否有上皮細(xì)胞壞死脫落、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫等情況。其中炎細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)3分，出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死脫落計(jì)1分，間質(zhì)水腫計(jì)1分。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 貓爪草納米乳對(duì)慢性咽炎大鼠咽部組織病理形態(tài)學(xué)的影響見圖5和表3。

表3 貓爪草納米乳噴霧劑對(duì)慢性咽炎大鼠模型病理學(xué)評(píng)分的影響 (分，

注:與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

空白對(duì)照組: 咽部黏膜層次結(jié)構(gòu)清晰，復(fù)層鱗狀上皮光滑完整，表層角化過度，黏膜下層未見水腫，可見個(gè)別炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5-A)。

模型對(duì)照組： 咽部黏膜復(fù)層鱗狀上皮壞死、脫落，黏膜下層增厚，間質(zhì)水腫、血管擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5-B)。

陽性對(duì)照組、貓爪草高劑量組、貓爪草中劑量組：咽部黏膜復(fù)層鱗狀上皮欠光滑，黏膜下層可見輕度水腫和血管擴(kuò)張充血，散在少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5-C、D、E)。

貓爪草低劑量組: 咽部黏膜復(fù)層鱗狀上皮局灶脫落，固有層及黏膜下層水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5-F)。

實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠病理學(xué)評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、貓爪草高劑量組大鼠病理學(xué)評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；貓爪草中劑量組大鼠病理學(xué)評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

納米乳又稱微乳，是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑等自發(fā)形成，粒徑為1～100 nm的熱力學(xué)穩(wěn)定、各向同性，透明或半透明的均相分散體系，由于其便于制備、作為藥物載體具有緩釋和靶向的作用，從而備受關(guān)注[12-13]。偽三元相圖法是目前國(guó)內(nèi)、外研究微乳的主要手段之一[14]，其主要目的是研究制備相圖時(shí)微乳相及其它狀態(tài)的分布區(qū)域情況，并考察不同組分配比時(shí)的性狀變化。該法可以通過微乳相面積的大小來判定微乳體系的相對(duì)穩(wěn)定程度，并通過選擇微乳區(qū)域中含乳化劑較少的點(diǎn)來確定制備微乳的各組分的大致比例[15]。本實(shí)驗(yàn)通過溶解度考察篩選出了適合制備貓爪草納米乳的油相、乳化劑和助乳化劑，采用水滴定法繪制偽三元相圖確定油相和乳化劑種類及Km。將貓爪草提取物制備成納米乳劑型后，所得納米乳粒徑小且呈正態(tài)分布，納米乳系統(tǒng)穩(wěn)定，性狀良好，澄清透明，不易分層和絮凝。

為了初步考察貓爪草納米乳對(duì)慢性咽炎的影響，本實(shí)驗(yàn)采用低濃度氨水直接噴霧法長(zhǎng)時(shí)間刺激大鼠咽部黏膜，建立慢性咽炎大鼠模型，操作方法簡(jiǎn)單安全，是目前使用最廣泛的模型建立方法[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組咽部黏膜層次結(jié)構(gòu)清晰，復(fù)層鱗狀上皮光滑完整，表層角化過度，黏膜下層未見水腫，可見個(gè)別炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組咽部黏膜復(fù)層鱗狀上皮壞死、脫落，黏膜下層增厚，間質(zhì)水腫、血管擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)復(fù)方一枝黃花噴霧劑和貓爪草納米乳噴霧劑干預(yù)后，慢性咽炎模型咽黏膜上皮細(xì)胞的增生和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)均有一定程度的緩解作用，動(dòng)物咽部組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低，說明貓爪草納米乳噴霧劑對(duì)慢性咽炎具有一定的療效，本文將對(duì)該制劑的深入研發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。