國內(nèi)首報(bào)Legius綜合征一家系及基因突變分析

陳志明 王小坡 孫建方 楊勇

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院遺傳病中心，南京210042；

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院病理科，南京210042

通信作者：王小坡，Email：13770757675@163.com；楊勇，Email：yyang@pumcderm.cams.cn

Legius 綜 合 征（Legius syndrome，LS；OMIM 611431）臨床表現(xiàn)與Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1；OMIM 162200）相似，又稱為類Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤樣綜合征（neurofibromatosis type 1?like syndrome），是由生殖細(xì)胞系SPRED1 基因雜合失功能突變引起的罕見常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑，可伴有腋窩和/或腹股溝雀斑、巨頭畸形，但缺少神經(jīng)纖維瘤、視神經(jīng)通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤、虹膜Lisch 結(jié)節(jié)、骨骼異常等NF1 典型癥狀。目前國外有100 余例LS 報(bào)道［1］，而國內(nèi)尚未見報(bào)道，我們對僅表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑的一個(gè)家系進(jìn)行基因檢測，結(jié)合臨床表現(xiàn)確診為LS。

對象與方法

一、臨床資料

先證者男，12 歲。因軀干、四肢泛發(fā)淡褐色斑12年于我院門診就診?；颊叱錾鷷r(shí)軀干即出現(xiàn)數(shù)個(gè)咖啡斑，逐漸擴(kuò)大、增多，無自覺癥狀。平素體健，智力發(fā)育正常，既往史及個(gè)人史無特殊。父母非近親結(jié)婚，先證者父母及外祖父母中僅其母親有類似癥狀（圖1）。體檢：一般情況好，發(fā)育正常，各系統(tǒng)均未見異常。皮膚科檢查（圖2A、2B）：軀干、四肢散在10余處邊界清楚、不規(guī)則或橢圓形、米粒至雞蛋大小咖啡色斑，腋窩、腹股溝可見散在淺褐色斑點(diǎn)，未見丘疹結(jié)節(jié)、虹膜Lisch結(jié)節(jié)。實(shí)驗(yàn)室檢查：血、尿常規(guī)和心臟彩色多普勒超聲檢查及脊柱正側(cè)位X 線和頭顱MRI 檢查均未見異常。先癥者母親軀干、四肢多發(fā)大小不一、不規(guī)則咖啡斑（圖2C），腋窩、腹股溝散發(fā)淺褐色斑點(diǎn)，余無特殊所見。

二、方法

1.全外顯子組測序：本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［（2019）臨審第（005）號］，患者監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。用乙二胺四乙酸抗凝管采集先證者、先證者父母及外祖父母外周血各2 ml，用Blood DNA Mini Kit（德國Qiagen 公司）提取全基因組DNA，將先證者DNA 送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司，使用PE150 測序系統(tǒng)（美國Illumina 公司）進(jìn)行人類全外顯子組高通量測序。外顯子測序后獲得原始數(shù)據(jù)，通過BWA 軟件進(jìn)行序列比對，采用GATK和VarScan軟件對變異識別，包括對SNP、InDel 等進(jìn)行檢測、注釋和統(tǒng)計(jì)分析。用Annovar 軟件從外部數(shù)據(jù)庫得到檢出的變異頻率、致病信息，對檢出的變異進(jìn)行注釋。根據(jù)分析結(jié)果，參考dbSNP、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）、Exac等數(shù)據(jù)庫找出致病突變。

2.Sanger測序驗(yàn)證突變：根據(jù)全外顯子組測序檢測到的突變，對家系各成員DNA 標(biāo)本進(jìn)行突變位點(diǎn)Sanger 測序驗(yàn)證。PCR 擴(kuò)增家系各成員SPRED1 基因第7 外顯子序列。使用PubMed Primer Blast在線設(shè)計(jì)引物，由北京擎科生物公司合成，正向引物5′?GTGGTATTTAAGACGCAGCC?3′，反向引物5′?CCAGAAATGGTTTCCTTCTG?3′。擴(kuò)增條件:98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s共35個(gè)循環(huán)，之后72 ℃延伸2 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后由北京擎科生物公司測序。測序結(jié)果應(yīng)用Chromas 軟件分析，并運(yùn)用DNAMAN 軟件與SPRED1基因參考序列進(jìn)行比對。

圖1 Legius綜合征患者家系圖

圖2 Legius綜合征先證者及其母親臨床表現(xiàn) 2A：先證者軀干多發(fā)不規(guī)則或橢圓形咖啡斑；2B：先證者腋窩見咖啡斑及不典型雀斑（黃色箭頭指示）；2C：先證者母親軀干多發(fā)不規(guī)則咖啡斑

結(jié) 果

先證者基因組DNA全外顯子組測序結(jié)果分析顯示，與多發(fā)性咖啡斑相關(guān)的NF、Noonan 綜合征、Costello 綜合征、LEOPARD 綜合征、Cardio?facio?cutaneous 綜合征和McCune?Albright 綜合征的致病基 因NF1、NF2、PTPN11、KRAS、HRAS、NRAS、BRAF、RAF1、SOS1、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MAS 均未發(fā)現(xiàn)致病突變，SPRED1 基因第7 號外顯子自第1 220 位核苷酸起發(fā)生19 個(gè)堿基雜合缺失（NM_152594，exon7，c.1220_1238del），引起氨基酸序列發(fā)生移碼突變（p.L407fs），成為候選致病突變。進(jìn)一步對先證者和其父母及外祖父母進(jìn)行SPRED1基因第7號外顯子PCR擴(kuò)增及正反向測序發(fā)現(xiàn)，先證者及患病母親均攜帶該雜合突變，先證者外祖父母、父親均未檢出該突變（圖3），該家系中該突變與疾病符合共分離。綜合臨床表現(xiàn)、病史和基因檢測結(jié)果，認(rèn)為SPRED1: c.1220_1238del:p.L407fs為該家系致病突變，先證者符合LS診斷。

討 論

圖3 Sanger 測序圖 先證者及母親SPRED1 基因第7 號外顯子從第1 220位核苷酸起發(fā)生堿基雜合缺失（紅色箭頭），先證者外祖父母未檢出該突變

LS 由Brems 等于2007 年首次報(bào)道，并且確定該病由SPRED1 基因失功能雜合突變引起［2］。SPRED1 蛋白由444 個(gè)氨基酸組成，包括3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，是腎素血管緊張素系統(tǒng)-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）重要抑制劑，通過調(diào)節(jié)RAS信號通路控制MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和衰老，對個(gè)體正常生長發(fā)育至關(guān)重要［3］。除SPRED1基因外，其他相關(guān)調(diào)控基因突變導(dǎo)致腎素血管緊張素系統(tǒng)-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常后可引起一組遺傳性綜合征群，因臨床表型均可出現(xiàn)顱面畸形、心血管系統(tǒng)異常、皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，又稱之為神經(jīng)-心臟-面部-皮膚綜合征，包括NF1、LS、Noonan 綜合征、Costello 綜合征、cardio?facio?cutaneous 綜合征和LEOPARD綜合征［4］。

LS 臨床表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑，部分可有腋窩和腹股溝區(qū)雀斑、眼距增寬、巨頭畸形、脂肪瘤，患者可伴有輕度學(xué)習(xí)障礙，但不發(fā)生神經(jīng)纖維瘤、視神經(jīng)膠質(zhì)瘤和虹膜Lisch 結(jié)節(jié)［1，5］。LS 需與NF1 鑒別診斷，據(jù)估計(jì)，高達(dá)5%符合美國國立衛(wèi)生研究院診斷NF1 標(biāo)準(zhǔn)的患者實(shí)際為SPRED1 基因突變導(dǎo)致的LS，而非NF1［6］。對現(xiàn)有報(bào)道病例分析表明，LS并發(fā)癥的嚴(yán)重程度以及并發(fā)惡性腫瘤概率均低于NF1［1］，因此早期對這兩種疾病進(jìn)行鑒別診斷對預(yù)后判斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷有重要意義。LS 與NF1早期均表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑，而NF1特異性表現(xiàn)需要到一定年齡才發(fā)生，所以通過臨床癥狀早期鑒別診斷較為困難，當(dāng)皮膚科醫(yī)生接診僅有多發(fā)性咖啡斑伴或不伴腋窩雀斑但缺少NF1 其他相關(guān)癥狀的患者時(shí)，應(yīng)考慮到LS 可能并可通過基因檢測進(jìn)行早期鑒別診斷。對患者進(jìn)行檢測時(shí)需注意的是，NF1 和SPRED1 基因均易發(fā)生大片段缺失［7］，而目前全外顯子組捕獲高通量測序方法無法檢出大片段缺失，因此，當(dāng)高度懷疑NF1和LS而采用全外顯子組測序未能發(fā)現(xiàn)NF1 或SPRED1 基因致病突變時(shí)，須采用多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation dependent probe amplification）排除大片段缺失可能。若基因檢測明確有NF1致病突變，則需嚴(yán)格定期至有處理NF1經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)院隨訪，重點(diǎn)監(jiān)測患者實(shí)體瘤如視路膠質(zhì)瘤、惡性周圍神經(jīng)鞘膜腫瘤的發(fā)生，骨骼系統(tǒng)異常和神經(jīng)系統(tǒng)異常［8］，而如果檢出SPRED1 致病突變，家長可自行觀察，重點(diǎn)關(guān)注患者生長發(fā)育以及學(xué)習(xí)情況。LS患者一般不需特殊治療，如果咖啡斑影響美觀可選擇激光治療。

本文先證者的母親亦有類似癥狀，基因檢測也檢出與先證者同一突變（SPRED1: exon7:c.1220_1238del:p.L407fs），先證者外祖父母和父親均未檢出該突變，證實(shí)該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，該新發(fā)突變在千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD、ExAC EAS數(shù)據(jù)庫以及諾禾致源正常人外顯子突變數(shù)據(jù)庫（NovoDb_WES）中均未見報(bào)道。截至目前，HGMD已收錄SPRED1 基因致病突變72 個(gè)（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SPRED1），主要突變類型為小片段缺失/插入（34/72）、錯義/無義突變（27/72），其余為大片段缺失和剪切突變。從目前報(bào)道的病例分析，尚未能發(fā)現(xiàn)基因型-臨床表型明顯相關(guān)性，SPRED1基因多個(gè)外顯子甚至整個(gè)基因缺失患者與僅有點(diǎn)突變患者的臨床表型相比無差別，較為特殊的1 例患者出現(xiàn)了腭裂，該患者染色體出現(xiàn)大片段缺失（6.6Mb），缺失片段包含SPRED1 以及另外29 個(gè)注釋參考基因［9］，既往研究者認(rèn)為這些注釋參考基因異常可引起唇腭裂與發(fā)育遲緩［10］。因此，還需要更多LS 患者臨床資料和突變數(shù)據(jù)來分析LS基因型-臨床表型相關(guān)性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突