Cu2+、Zn2+脅迫對粉黛亂子草種子萌發(fā)及抗氧化特征影響

許志敏, 陳 琳, 劉燕珍, 林 濤, 何 侃, 丁國昌

(福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州 350002)

近年來，重金屬污染問題日益加劇，銅、鋅、鎘和鉛已經(jīng)成為主要的重金屬污染元素[1-3]，其中全球每年釋放到環(huán)境中的銅為14.7×104t，鋅為27.6×104t[4]，對土壤質(zhì)量、生態(tài)環(huán)境及人體健康等造成嚴(yán)重威脅[5].隨著城市化和工業(yè)化的快速發(fā)展，重金屬污染已不僅僅存在于尾礦區(qū)、周邊農(nóng)田和水體區(qū)域，城市中的不同功能區(qū)土壤重金屬污染狀況也日趨嚴(yán)峻.例如北京市城區(qū)存在廣泛的鎘、銅和鋅污染，各功能區(qū)受土壤污染程度排名前3的為工業(yè)區(qū)>商貿(mào)區(qū)>公園區(qū)[6]；福州市各功能區(qū)重金屬綜合污染指數(shù)的排序為工業(yè)區(qū)>交通區(qū)>居住區(qū)>公園區(qū)，且各功能區(qū)均屬于重度污染[7].同時，重金屬污染往往是多種重金屬復(fù)合污染.生物措施是修復(fù)重金屬污染區(qū)域有效方式之一，但不同的植物種類或個體對重金屬修復(fù)能力各不相同，因此開展高效修復(fù)能力的植物種類或個體及相關(guān)機(jī)制研究具有重要意義.

粉黛亂子草[Muhlenbergiacapillaris(Lamarck) Trinius]為禾本科亂子草屬(Muhlenbergia)植物，是多年生暖季型觀賞草，可在北京以南地區(qū)生長，具有生長速度快、生物量大、適應(yīng)性強、管護(hù)方便等特性[8].夏秋季開放粉色霧狀花序，如夢如幻，觀賞價值極高，近年逐漸被應(yīng)用于街頭綠地、別墅庭院和觀賞專類園等.目前針對粉黛亂子草的研究主要集中在生態(tài)適應(yīng)性[9]、耐熱耐旱性研究[10]、觀賞價值評價[11]等方面，關(guān)于粉黛亂子草對不同重金屬的耐受性研究鮮有報道，且銅鋅復(fù)合脅迫對粉黛亂子草種子的萌發(fā)特性和生理響應(yīng)機(jī)制還未見報道.

本試驗采用不同質(zhì)量濃度的銅、鋅溶液及其混合溶液對粉黛亂子草種子進(jìn)行脅迫處理，測定脅迫14 d后粉黛亂子草的各項種子萌發(fā)指標(biāo)、幼苗生長指標(biāo)及抗氧化酶活性指標(biāo)，探究粉黛亂子草被銅、鋅毒害后種子萌發(fā)特性和抗氧化酶活性的變化規(guī)律.利用隸屬函數(shù)法，綜合評析粉黛亂子草萌發(fā)期對3種不同重金屬的耐受性.以期為粉黛亂子草耐重金屬機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，同時為各類土壤重金屬污染區(qū)域的植被應(yīng)用和生態(tài)修復(fù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗材料為粉黛亂子草種子，采購自江蘇省沭陽縣溢芳花卉園.用0.1%高錳酸鉀溶液消毒浸泡種子15 min后，蒸餾水反復(fù)沖洗5～6遍，用蒸餾水浸泡24 h，除去漂浮的劣質(zhì)種子，余下的種子用濾紙吸干表面的水分，用于脅迫試驗.

1.2 試驗方法

依據(jù)國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值，銅和鋅溶液分別采用CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O配制(表1)，設(shè)置7個處理：T1、T2、T3、T4、T5、T6，以蒸餾水為對照(CK).培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、空氣相對濕度75%、1 d內(nèi)光照14 h，光照度6 000 lx，1 d內(nèi)黑暗10 h.取直徑9 cm的一次性培養(yǎng)皿，鋪置1層脫脂棉和濾紙作為發(fā)芽床，每個培養(yǎng)皿50粒種子，每個處理重復(fù)6次，其中3個重復(fù)用于測定幼苗形態(tài)指標(biāo)，另外3個重復(fù)用于測定萌發(fā)過程中抗氧化酶活性指標(biāo).培養(yǎng)期間每天通過向培養(yǎng)皿內(nèi)增加相應(yīng)的處理液以維持質(zhì)量濃度基本不變并保持濕潤.每天觀察記錄種子萌發(fā)情況.

表1 銅、鋅及銅鋅復(fù)合脅迫梯度值
Table 1 Gradient values for Cu2+, Zn2+, Cu2++Zn2+composite stress mg·L-1

溶液對照組(CK)處理組T1T2T3T4T5T6Cu2+050100200300500600Zn2+050100200400600800Cu2++Zn2+050+50100+100200+200300+400400+600500+800

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 種子發(fā)芽指標(biāo)測定 發(fā)芽以胚根露白為標(biāo)準(zhǔn)，每天定時觀察記錄種子發(fā)芽數(shù)[12].第4天統(tǒng)計種子發(fā)芽勢，第14天[13]結(jié)束發(fā)芽試驗，統(tǒng)計種子發(fā)芽率.

發(fā)芽率/%=第14天萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100

發(fā)芽勢/%=第4天萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(Gt指在t時間內(nèi)發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù))[14]

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×苗長度

1.3.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定 第14天試驗結(jié)束，從用于形態(tài)指標(biāo)測定的培養(yǎng)皿中各取出10株長勢一致的幼苗，用游標(biāo)卡尺測量胚芽長和胚根長，讀數(shù)精確到0.01 mm，用電子天平稱量幼苗鮮重.

1.3.3 生理指標(biāo)測定 第14天試驗結(jié)束，從用于生理指標(biāo)測定的培養(yǎng)皿中取出0.2 g幼苗，放置于5 mL的離心管后在球磨機(jī)內(nèi)研磨成勻漿，加入4 mL的0.05 mol·L-1(pH=7.8)磷酸緩沖液于離心管中，于4 ℃下10 000 r·min-1冷凍離心20 min，取上清液立即放入4 ℃冰箱儲存待測.參考王學(xué)奎[15]的方法測定丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性.使用多功能酶標(biāo)儀測定各指標(biāo)的吸光度值.耐銅鋅脅迫能力評價采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值的方法進(jìn)行抗逆性綜合評定[16]：

隸屬函數(shù)值的換算方法：

A：R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

B：R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

C：R(Xi)=Xij/n

式中：R(Xi)表示i處理j指標(biāo)的耐銅鋅隸屬函數(shù)值，Xij表示i處理j指標(biāo)的測定值，Xjmax和Xjmin分別表示各處理的最大和最小的測定值，Xi為i處理的耐銅鋅隸屬函數(shù)值的平均值，n為指標(biāo)數(shù).

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析均基于Excel 2010和SPSS 23.0軟件進(jìn)行，采用Excel 2010軟件作圖.運用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，有顯著或極顯著差異時用DUNCAN法進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 脅迫對粉黛亂子草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

3種脅迫對粉黛亂子草的發(fā)芽率均具有抑制作用，隨溶液質(zhì)量濃度的升高呈先增后減的趨勢(圖1).3種脅迫的溶液質(zhì)量濃度為T1時，粉黛亂子草的發(fā)芽率均高于對照組(53.33%)；從T2后，發(fā)芽率均呈不同程度的下降趨勢，鋅脅迫時，下降幅度最小，從T3-T6濃度依次下降13.74%、18.75%、21.25%、42.49%；銅脅迫時，下降幅度最大，從T3-T6濃度依次下降76.24%、83.74%、86.26%、90.00%.3種脅迫的溶液質(zhì)量濃度為T6時，發(fā)芽率達(dá)到最低值，抑制作用最顯著，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫下的發(fā)芽率分別為5.33%、30.67%、12.67%.

3種脅迫隨著溶液質(zhì)量濃度的升高，發(fā)芽勢均呈先增后減的趨勢(圖2).3種脅迫的溶液質(zhì)量濃度為T1時，粉黛亂子草的發(fā)芽勢均高于對照組(20.67%)，鋅脅迫時最高(26.67%).3種脅迫的溶液質(zhì)量濃度為T2時，發(fā)芽勢逐漸下降，在T6時均達(dá)到最低，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫下的發(fā)芽勢分別為0%、9.33%、3.33%.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖1 不同脅迫處理對粉黛亂子草種子發(fā)芽率的影響
Fig.1 Effects of different levels of stress on the gernination rate ofM.capillarisseeds

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖2 不同脅迫處理對粉黛亂子草種子發(fā)芽勢的影響
Fig.2 Effects of different levels of stress on the germination potential ofM.capillarisseeds

2.2 脅迫對粉黛亂子草種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

粉黛亂子草的發(fā)芽指數(shù)隨處理溶液質(zhì)量濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(圖3).在T1時，3種脅迫對粉黛亂子草的發(fā)芽指數(shù)均有促進(jìn)作用.隨著溶液質(zhì)量濃度的升高，3種脅迫下的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，其中，鋅脅迫處理下的發(fā)芽指數(shù)下降幅度最小，在T3、T4、T5、T6處理時與對照相比分別下降了5.90%、10.89%、14.21%、 30.63%；銅脅迫下的發(fā)芽指數(shù)下降幅度最大，在T3、T4、T5、T6處理時與對照相比分別下降了75.09%、84.69%、91.14%、93.54%.

粉黛亂子草的活力指數(shù)與脅迫濃度呈反比(圖4)，即處理溶液質(zhì)量濃度越高，活力指數(shù)越低.在T1時，粉黛亂子草的活力指數(shù)與對照組無顯著差異，且3種脅迫下的活力指數(shù)相近，分別為19.49、19.71、19.52.在3種脅迫下的T2濃度后，活力指數(shù)與對照組差異顯著(P<0.05)，且處理溶液質(zhì)量濃度越高，差異越顯著.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖3 不同脅迫處理對粉黛亂子草種子發(fā)芽指數(shù)的影響
Fig.3 Effects of different levels of stress on the germination index ofM.capillarisseeds

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖4 不同脅迫處理對粉黛亂子草種子活力指數(shù)的影響
Fig.4 Effects of different levels of stress on the vitality index ofM.capillarisseeds

2.3 脅迫對粉黛亂子草幼苗胚芽和胚根生長的影響

表2 不同濃度Cu2+、Zn2+處理下粉黛亂子草幼苗生長情況1)Table 2 Growth performances of 8 varieties of M.capillaris seedings under different levels of Cu2+ and Zn2+ stress

1)-表示沒有根生長.表中同列間不同字母表示差異顯著(P<0.05).

3種脅迫對粉黛亂子草幼苗的生長均具有抑制作用，幼苗出現(xiàn)不同程度的毒害效應(yīng)(表2).隨著3種脅迫濃度的增大，粉黛亂子草的胚苗長、胚根長和幼苗鮮重均呈遞減趨勢，并顯著低于對照(P<0.05).在3種脅迫的各處理下，胚苗長、幼苗鮮重下降幅度和趨勢相近；但胚根長的變化趨勢存在差異，鋅脅迫下的胚根生長情況明顯優(yōu)于銅脅迫和銅鋅復(fù)合脅迫，其中，銅脅迫下的胚根長受到抑制作用最顯著.在Cu-T4、Cu-T5、Cu-T6，Zn-T6，Cu+Zn-T4、Cu+Zn-T5、Cu+Zn-T6脅迫下，粉黛亂子草出現(xiàn)“無根苗”和芽苗幼小癥狀，且胚根長在銅脅迫和銅鋅復(fù)合脅迫時顯著低于鋅脅迫.

2.4 脅迫對粉黛亂子草葉片MDA含量的影響

隨著3種溶液質(zhì)量濃度的增高，粉黛亂子草葉片的MDA含量呈逐漸升高的趨勢(圖5).3種脅迫的溶液質(zhì)量濃度為T1時，MDA含量與對照相比均無顯著差異； T2及以上時，銅、銅鋅復(fù)合處理的MDA含量均顯著高于對照(P<0.05)，而鋅脅迫在T3及以上時，MDA含量顯著高于對照組(P<0.05).當(dāng)3種脅迫的溶液質(zhì)量濃度達(dá)到T6時，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫處理的MDA含量分別是對照的2.92、2.36和3.17倍.

2.5 脅迫對粉黛亂子草葉片CAT活性、POD活性和SOD活性的影響

隨著3種溶液質(zhì)量濃度的增高，CAT活性均呈先升高后降低的趨勢，均于T3時達(dá)到最高(圖6).在T4時，3種脅迫下的CAT活性均急劇下降，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫脅迫時CAT活性較T3分別較低35.58%、52.31%和37.46%.隨溶液質(zhì)量濃度的升高，CAT活性持續(xù)下降，在T6時達(dá)到最低值，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫脅迫時CAT活性與對照組相比下降了71.11%、43.31%和58.37%.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖5 不同脅迫處理對粉黛亂子草葉片MDA含量的影響
Fig.5 Effects of different levels of stress on the MDA content ofM.capillarisleaves

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖6 不同脅迫處理對粉黛亂子草葉片CAT活性的影響
Fig.6 Effects of different levels of stress on the CAT activity ofM.capillarisleaves

隨著3種脅迫濃度的升高，POD活性均呈先升高后降低的趨勢(圖7).在T1濃度時POD活性均達(dá)到最高值，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫處理時較對照分別增高了7.16%、5.46%和3.15%.在T2脅迫時，POD活性開始下降，但均高于對照組.在T3脅迫后，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫下的POD活性均低于對照組，在T6脅迫時達(dá)到最低值，分別為170.46、169.85和167.87 μg·min-1.

隨著3種溶液質(zhì)量濃度的升高，SOD活性均呈先增后減的趨勢(圖8).在T1脅迫時，3種脅迫下的SOD活性較對照組均有所提高，銅、鋅和銅鋅復(fù)合脅迫的SOD活性分別較對照提高了3.58%、2.95%和4.44%.在T3脅迫時，SOD活性下降幅度大且顯著低于對照；在T4脅迫后，SOD活性降低幅度趨勢平緩；在T6脅迫時，3種脅迫下的SOD活性均達(dá)到最低值.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖7 不同脅迫處理對粉黛亂子草葉片POD活性的影響
Fig.7 Effects of different levels of stress on the POD activity ofM.capillarisleaves

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).
圖8 不同脅迫處理對粉黛亂子草葉片SOD活性的影響
Fig.8 Effects of different levels of stress on the SOD activity ofM.capillarisleaves

2.6 脅迫下粉黛亂子草種子萌發(fā)和幼苗生長的抗逆性綜合評價

單一的指標(biāo)評判植物對重金屬的抗性存在一定的片面性，通過隸屬函數(shù)法可將各指標(biāo)進(jìn)行綜合評價[17].根據(jù)表3得知，3種脅迫處理下粉黛亂子草各測定指標(biāo)的綜合隸屬函數(shù)值依次為CK>Zn-T1>Cu-T1>Cu+Zn-T1>Zn-T2>Zn-T3>Cu+Zn-T2>Cu-T2>Zn-T4>Cu+Zn-T3>Zn-T5>Cu-T3>Zn-T6>Cu-T4>Cu+Zn-T4>Cu+Zn-T5>Cu-T5>Cu+Zn-T6>Cu-T6.結(jié)果表明，粉黛亂子草在萌發(fā)期對3種重金屬耐受性強弱依次為Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+.

表3 不同處理下粉黛亂子草各測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 3 Subordinate function values for the physiological indicators of M.capillaris under different stress

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物感知外界環(huán)境的最初生命階段，也是對外界環(huán)境最敏感的時期[18]，其期間的生長狀況直接影響今后的生長發(fā)育、觀賞價值及開發(fā)利用途徑等.通過觀察逆境脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，在一定程度上能夠反映植物對逆境脅迫的耐性[19].

本研究結(jié)果表明，隨銅溶液、鋅溶液和銅鋅混合溶液質(zhì)量濃度的升高，粉黛亂子草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈先增后減的趨勢，當(dāng)銅脅迫T1(50 mg· L-1)時、鋅脅迫T1(50 mg· L-1)時、銅鋅復(fù)合脅迫T1(50 mg· L-1+50 mg· L-1)時，粉黛亂子草的上述發(fā)芽指標(biāo)高于對照，表明T1對粉黛亂子草種子萌發(fā)具有一定地促進(jìn)作用；當(dāng)銅脅迫T2(100 mg· L-1)時、鋅脅迫T3(200 mg· L-1)時、銅鋅復(fù)合脅迫T3(200 mg· L-1+200 mg· L-1)時，上述發(fā)芽指標(biāo)開始受到顯著抑制作用，且隨質(zhì)量濃度的升高抑制作用越強，這與孫金金等[20]研究重金屬對草種子萌發(fā)的影響存在低促高抑效應(yīng)一致.活力指數(shù)、胚苗長、胚根長和幼苗鮮重隨3種溶液質(zhì)量濃度的升高而逐漸下降，在T1脅迫時，幼苗生長受到顯著抑制作用，且溶液質(zhì)量濃度越高，抑制作用越強烈；3種脅迫對粉黛亂子草幼苗生長的抑制作用存在差異，表現(xiàn)為Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+，這可能是其受到的毒害作用主要是由銅造成的，而鋅在一定程度上緩解了部分毒害作用[21]，還有待于進(jìn)一步研究.同時在3種脅迫處理的T6時，粉黛亂子草均出現(xiàn)“無根苗”，表明在3種重金屬脅迫下，粉黛亂子草的根系比莖葉受害程度更加劇烈.夏曄[22]對重金屬對小麥種子的萌發(fā)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，高濃度脅迫對小麥根的抑制作用大于芽，且亦出現(xiàn)“無根苗”.由于根是植物吸收水分和養(yǎng)分的器官[23]，粉黛亂子草的根與重金屬溶液接觸，導(dǎo)致根的重金屬累積量以及受迫時間比胚苗長，因此胚根比胚苗受到的毒害作用更強[24].

逆境脅迫會影響植物體內(nèi)抗氧化酶活性及其化學(xué)性質(zhì)等，活性氧水平上升產(chǎn)生大量丙二醛，造成膜脂過氧化作用，阻礙植物正常生長[25].本研究結(jié)果表明，粉黛亂子草葉片的MDA含量與3種脅迫溶液質(zhì)量濃度呈正比，這與王麗艷等[26]、孔德政等[27]研究結(jié)果一致.當(dāng)3種處理溶液質(zhì)量濃度為T1時，細(xì)胞的防御機(jī)制使MDA維持在一定的水平，使細(xì)胞膜處于穩(wěn)定狀態(tài)；當(dāng)濃度超過臨界值T3時，細(xì)胞內(nèi)代謝失衡，自由基大量積聚，導(dǎo)致MDA含量大幅度的增加.CAT作為重要的酶促清除系統(tǒng)，在清除植物體內(nèi)過氧化氫、維持氧自由基平衡、減輕逆境對植物的損害等方面具有重要作用[28].本試驗中粉黛亂子草的CAT活性隨脅迫濃度的增大呈先增后減的趨勢.在3種處理溶液質(zhì)量濃度為T3之前，粉黛亂子草CAT活性逐漸提高；而在T4后，CAT活性急劇下降，說明高質(zhì)量濃度的重金屬溶液使幼苗清除體內(nèi)活性氧能力顯著降低，自生的抗逆境能力亦大幅下降.不同重金屬處理之間的CAT活性存在差異，表現(xiàn)為Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+，這與粉黛亂子草在3種脅迫下的萌發(fā)特性受到抑制情形一致，有待進(jìn)一步探究.

SOD和POD作為防止植物細(xì)胞中活性氧簇產(chǎn)生的重要抗氧化酶[29]，二者活性的提高與維持是植物抗逆境脅迫的重要生理基礎(chǔ)[30].本試驗中3種脅迫處理下粉黛亂子草的SOD和POD活性均呈先增后減的趨勢，這與曹萌等[31]研究重金屬對豌豆幼苗抗性生理指標(biāo)的影響結(jié)果一致，表明了其抗逆的協(xié)同性，并共同組成了防御過氧化系統(tǒng)，抵抗不良環(huán)境條件對機(jī)體的破壞[32].當(dāng)3種重金屬脅迫濃度較低時，其SOD、POD活性有上升的趨勢，表明粉黛亂子草具有一定的耐性；當(dāng)3種重金屬脅迫濃度升高時，高濃度的重金屬離子會明顯抑制抗氧化酶活性，導(dǎo)致活性氧的加劇釋放，使植物生長發(fā)育受阻.

通過對3種重金屬脅迫下粉黛亂子草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚苗長、胚根長、幼苗鮮重、MDA、CAT、SOD、POD等參數(shù)的分析，可以較全面地評析粉黛亂子草萌發(fā)期對重金屬耐受性.采用隸屬函數(shù)法綜合分析得出粉黛亂子草對3種重金屬耐受性強弱依次為Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+.本試驗僅探討在種子萌發(fā)期，單一銅、單一鋅和復(fù)合銅鋅脅迫條件下對粉黛亂子草種子的萌發(fā)特性、幼苗生長和抗氧化特征，對粉黛亂子草成年植株的抗逆解毒機(jī)制、富集轉(zhuǎn)運規(guī)律、分子水平及細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的影響還有待進(jìn)一步深入研究.