甲酸與木質(zhì)磺酸混合物對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響

周嘉鑫, 黃義強(qiáng), 林智鑫, 王全溪, 高玉云, 王長(zhǎng)康

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

隨著國(guó)家對(duì)部分抗生素的禁用，未來(lái)禁止在飼料中添加抗生素已是大勢(shì)所趨.酸化劑能改善飼料的適口性，提高動(dòng)物采食量，促進(jìn)胃腸道黏膜上皮生長(zhǎng)，調(diào)整和改善消化道的內(nèi)環(huán)境，抑制和殺滅有害菌，調(diào)節(jié)胃排空速度，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[1].甲酸(formic acid, FA)除了具有可降低胃腸道pH的常規(guī)特點(diǎn)外，還可直接進(jìn)入致病菌細(xì)胞內(nèi)酸化細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，阻礙其遺傳物質(zhì)及蛋白質(zhì)的合成，抑制致病菌的生長(zhǎng)與繁殖，具有極強(qiáng)的抗菌特性[2]，但由于FA的強(qiáng)腐蝕性可能會(huì)對(duì)腸道造成損傷，在生產(chǎn)中的應(yīng)用并不廣泛.木質(zhì)磺酸(lignosulfonic acid, LA)已被證明對(duì)小鼠具有降血糖和抗菌等功能[3-4]，但在畜牧業(yè)中鮮有LA的應(yīng)用報(bào)道，LA在畜牧業(yè)中具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力.LA是一種高分子、體積大及芳香環(huán)上位阻大的物質(zhì)[5]，這些特點(diǎn)導(dǎo)致LA反應(yīng)活性低，只有在特殊條件下才會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如強(qiáng)酸的環(huán)境下[6].LA特殊的陰性大分子空間結(jié)構(gòu)，對(duì)小分子有機(jī)酸等陽(yáng)性分子具有極強(qiáng)的吸附作用[7].因此，LA與FA混合后，LA可以作為FA的載體使混合物維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài).在動(dòng)物飲用水中添加甲酸與木質(zhì)磺酸的混合物(mixture of formic acid and lignosulfonic acid, MFALA)，期望LA能夠改善FA易揮發(fā)、腐蝕性強(qiáng)及破壞日糧營(yíng)養(yǎng)成分等問(wèn)題并維持腸道健康[8].本試驗(yàn)在飲用水中添加不同比例的MFALA，研究MFALA對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能及空腸組織結(jié)構(gòu)、緊密連接蛋白和免疫因子的影響，并探討適宜的添加量，為黃羽肉雞的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

40% LA和98% FA由麥侖(漳州)生物科技有限公司提供.240羽1日齡黃羽肉雞公雛購(gòu)自福建莆田廣東溫氏家禽有限公司.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將240羽1日齡體重相近的雄性黃羽肉雞隨機(jī)分為4組，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞.試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組肉雞在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，分別飲用含0%、0.15%、0.20%和0.25% MFALA的水，試驗(yàn)期21 d.在MFALA中，F(xiàn)A占比60%，LA占比40%.

1.3 日糧的配制

基礎(chǔ)日糧參照NY/T 33—2004[9]的方法配制.基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，供試日糧為粉狀料.

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1)預(yù)混料為每千克日糧提供9 100 IU VA、2 100 IU VD3、21 IU VE、2.1 mg VK3、2.1 mg VB1、5.1 mg VB2、3.6 mg VB6、0.02 mg VB12、36 mg煙酸、11 mg泛酸鈣、1.1 mg葉酸、0.16 mg生物素、700 mg氯化膽堿、8 mg Cu、80 mg Fe、 80 mg Mn、80 mg Zn、0.35 mg I、0.25 mg Se；2)代謝能為計(jì)算值.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞自由采食、飲水，全程采用籠養(yǎng)的方式飼喂21 d，每天光照24 h，采用福建莆田廣東溫氏家禽有限公司提供的方法進(jìn)行常規(guī)免疫.

1.5 樣品采集及制備

肉雞飼喂21 d后禁食12 h，稱(chēng)重，各重復(fù)選取2只體重中等的肉雞進(jìn)行屠宰取樣.開(kāi)膛后，剝離空腸，迅速放入液氮罐中，再轉(zhuǎn)至-80 ℃低溫冰箱凍存.取3小段空腸中段，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗后，兩段裝入標(biāo)記好的10 mL離心管中，迅速放入液氮罐中，再轉(zhuǎn)至-80 ℃低溫冰箱凍存；另一段用于組織切片.

1.6 指標(biāo)的觀察與測(cè)定

1.6.1 生長(zhǎng)性能 測(cè)定內(nèi)容包括平均日采食量、平均日增重和料重比等.

1.6.2 空腸組織結(jié)構(gòu) 空腸組織經(jīng)4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定、無(wú)水乙醇脫水后用石蠟包埋，連續(xù)切片(每塊腸段切3片，厚度5 μm)、脫蠟、HE染色、封片，使用顯微鏡觀察測(cè)量絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值.

1.6.3 空腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1基因及免疫因子IL-4、IL-6基因的表達(dá) 采用Total RNA Kit Ⅰ(美國(guó)OMEGA公司)提取空腸總RNA，然后用Eastep?RT Master Mix Kit(美國(guó)Promega公司)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得的cDNA用Go Taq?qPCR Master Mix(美國(guó)Promega公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng).內(nèi)參基因及目的基因的上下游引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算內(nèi)參基因和目的基因的Ct值，利用2-△△Ct公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量.

表2 內(nèi)參基因和目的基因的引物序列Table 2 Primer sequences of reference genes and target genes

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 MFALA對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可以看出，Ⅱ組肉雞的平均日增重顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，各組間的平均日采食量、料重比和成活率差異不顯著(P>0.05).

表3 MFALA對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響1)Table 3 Effects of MFALA on the growth performance of yellow broilers

1)同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者或無(wú)字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.2 MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸組織結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知：Ⅱ組肉雞空腸的絨毛高度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，各組間的隱窩深度差異不顯著(P>0.05)；Ⅱ組肉雞的絨毛高度/隱窩深度顯著高于Ⅰ組(P<0.05).

表4 MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸組織結(jié)構(gòu)的影響1)Table 4 Effect of MFALA on the jejunal structure integrity of yellow broiler

1)同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者或無(wú)字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.3 MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸緊密連接蛋白和免疫因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可知：Ⅱ組肉雞空腸occludin和claudin-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，其余各組間的差異不顯著(P>0.05)；Ⅰ組肉雞空腸IL-4基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于Ⅱ和Ⅲ組(P<0.05)，Ⅲ組顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，其余各組間的差異不顯著(P>0.05)；Ⅰ組肉雞空腸IL-6基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅱ和Ⅳ組(P<0.05)，其余各組間的差異不顯著(P>0.05).

3 討論

3.1 MFALA對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飲用水中添加MFALA顯著提高黃羽肉雞的平均日增重，此結(jié)果與其他學(xué)者[8，10-12]研究FA對(duì)畜禽生長(zhǎng)性能影響的結(jié)論類(lèi)似.Panda et al[10]研究表明，在日糧中添加0.6% FA可以顯著提高42日齡肉雞的體增重，顯著降低料重比，且與添加抗生素組的效果相當(dāng)，但1% FA組的效果不顯著.Ragaa et al[11]研究表明，在日糧中添加0.5% FA可以顯著提高35日齡肉雞的體增重，顯著降低料重比，且與添加0.5%二甲酸鉀組的效果相當(dāng).Ragaa et al[8]研究表明，在日糧中添加0.5% FA可以顯著提高35日齡肉雞的體增重，顯著降低料重比和采食量，且與添加0.5% FA+0.1%百里香酚組的效果相當(dāng).Ghazalah et al[12]研究表明，在日糧中添加0.5% FA能顯著提高42日齡肉雞的體增重，但添加1%組與對(duì)照組的差異不顯著.本試驗(yàn)根據(jù)上述研究結(jié)果結(jié)合雛雞飲水量與采食量的關(guān)系[13]設(shè)計(jì)了MFALA濃度梯度，試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相符.據(jù)報(bào)道，F(xiàn)A能顯著抑制腸道中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的定植，有效促進(jìn)乳酸桿菌的繁殖[14].目前在畜牧業(yè)中鮮有LA的相關(guān)研究報(bào)道，但已有報(bào)道指出LA對(duì)小鼠有廣泛抗病毒的能力，其中包括抗艾滋病病毒和抗單純皰疹病毒[15].本試驗(yàn)中，黃羽肉雞生產(chǎn)性能的提高可能是由于MFALA提高了機(jī)體的免疫能力，而Ⅲ和Ⅳ組肉雞的生長(zhǎng)性能與Ⅰ組相比差異不顯著，可能是MFALA超過(guò)了飲用水最佳的添加量.

3.2 MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道絨毛高度、隱窩深度和絨毛表面積是體現(xiàn)小腸吸收能力的主要指標(biāo)[16].Ragaa et al[11]研究表明，在日糧中添加0.5% FA或0.5%二甲酸鉀可顯著提高42日齡肉雞回腸的絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值.Hernández et al[17]研究表明，在日糧中添加0.5% FA能顯著提高42日齡肉雞十二指腸的絨毛高度和隱窩深度，但絨毛高度與添加1% FA組的差異不顯著.刁慧[18]研究表明，有機(jī)酸對(duì)腸道組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，由于有機(jī)酸降低了胃腸道的pH，維持腸道的穩(wěn)態(tài).本試驗(yàn)在飲用水中添加MFALA可顯著提高黃羽肉雞空腸的絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值，此結(jié)果與上述研究結(jié)果相似.Giridhar et al[19]研究顯示，LA與海藻酸鈉混合在強(qiáng)酸條件下交聯(lián)減少，吸水率和降解速度降低，表明此類(lèi)混合物有作為藥物運(yùn)輸載體的潛力.LA可能會(huì)起到類(lèi)似增塑劑的效果，使FA的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，降低FA的腐蝕性對(duì)肉雞腸道的傷害.本試驗(yàn)結(jié)果表明，MFALA能促進(jìn)黃羽肉雞空腸絨毛的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，而Ⅲ和Ⅳ組肉雞空腸的結(jié)構(gòu)指標(biāo)與Ⅰ組的差異不顯著，可能是MFALA超過(guò)了飲用水最佳的添加量，此結(jié)果與“在日糧中添加1%FA對(duì)肉雞腸道沒(méi)有產(chǎn)生有益影響”的結(jié)論[17]一致.這可能是高濃度的FA在調(diào)節(jié)肉雞腸道菌群的同時(shí)，也對(duì)腸道產(chǎn)生了腐蝕傷害.

3.3 MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸緊密連接蛋白的影響

緊密連接蛋白是多種蛋白相互作用形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)蛋白[20]，其主要功能是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的進(jìn)出，有效防止腸道內(nèi)細(xì)菌和毒素等有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，維持上皮屏障功能的完整[21].occludin和claudin-1為緊密連接蛋白中的主要跨膜蛋白.claudin-1蛋白主要起細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞連接處選擇滲透性[22]；occludin蛋白在細(xì)胞膜上分布最廣，在細(xì)胞間主要發(fā)揮粘附分子的作用，具有維持和調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的屏障功能[23].本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定黃羽肉雞空腸中occludin和claudin-1基因的相對(duì)表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)MFALA對(duì)空腸緊密連接蛋白的影響.

Matsuhisa et al[24]通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LA不僅能增強(qiáng)緊密連接蛋白的功能，而且能恢復(fù)由炎性細(xì)胞因子損傷的緊密連接蛋白屏障，此結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相符.本試驗(yàn)中，MFALA可顯著上調(diào)肉雞空腸occludin和claudin-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，這可能是由于幼齡黃羽肉雞的腸道還未發(fā)育成熟，MFALA對(duì)腸道細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用，導(dǎo)致緊密連接蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào).MFALA有助于加強(qiáng)腸道上皮機(jī)械屏障的作用，減少有害物質(zhì)從腸道進(jìn)入機(jī)體，從而促進(jìn)黃羽肉雞的生長(zhǎng).而Ⅲ和Ⅳ組肉雞occludin和claudin-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Ⅰ組相比差異不顯著，可能是MFALA超過(guò)了飲用水最佳的添加量，F(xiàn)A在飲用水中的添加量超過(guò)了限度，會(huì)對(duì)腸道產(chǎn)生傷害，導(dǎo)致緊密連接蛋白基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著上升.

3.4 MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸免疫因子的影響

腸道免疫能力是保障動(dòng)物腸道健康的關(guān)鍵，可防止病原體和有害抗原通過(guò)腸道對(duì)機(jī)體健康造成影響[25].腸道免疫因子是評(píng)價(jià)腸道免疫能力的重要指標(biāo).本試驗(yàn)測(cè)定抗炎因子IL-4基因和促炎因子IL-6基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量評(píng)價(jià)MFALA對(duì)黃羽肉雞空腸免疫因子的影響.

研究表明：在日糧中添加0.5%復(fù)合有機(jī)酸+植物提取物顯著降低斷奶仔豬回腸IL-6和IL-12基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，復(fù)合有機(jī)酸+植物提取物似乎是通過(guò)減少促炎反應(yīng)來(lái)提高免疫力而不是增強(qiáng)抗炎反應(yīng)，從而正向調(diào)節(jié)腸道上皮的炎癥應(yīng)激[26]；在日糧中添加0.002%γ-羥基丁酸有調(diào)節(jié)腸道免疫的作用，可上調(diào)斷奶仔豬回腸抗炎細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10基因的表達(dá)量[27]；在日糧中添加植酸鈉可降低大鼠血清TNF-α和IL-6基因的表達(dá)量，并減輕大鼠由于高脂飲食引起的炎癥反應(yīng)[28].本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似.本試驗(yàn)中，Ⅱ和Ⅲ組肉雞空腸IL-4基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著提高，Ⅱ和Ⅳ組肉雞空腸IL-6基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，表明MFALA可能可以減少肉雞腸道的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)抗炎能力，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力.

4 結(jié)論

在飲用水中添加MFALA能改善黃羽肉雞空腸的組織結(jié)構(gòu)、緊密連接蛋白和免疫因子，提高黃羽肉雞的生產(chǎn)性能，最適添加量為0.15%.