PUGNAc對(duì)羅非魚肝臟NAGase的抑制動(dòng)力學(xué)

申奔龍, 陳曉佳, 黃小紅, 張偉妮,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院，福建 福州 350002)

羅非魚(Oreochromissp.)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖魚類之一，中國(guó)羅非魚的產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的40%以上[1].羅非魚因具有生長(zhǎng)速度快、生存能力強(qiáng)和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，易于池塘、網(wǎng)箱、稻田或浮筏養(yǎng)殖，又因其肉質(zhì)好、口感好、蛋白質(zhì)含量高[2]，長(zhǎng)期以來受許多發(fā)展中國(guó)家人民的喜愛.

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAGase)是一種重要的溶酶體酶，主要水解糖蛋白、蛋白聚糖及多糖分子內(nèi)以β-1,4-糖苷鍵連接的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷鍵，同時(shí)它也是幾丁質(zhì)降解途徑中的限速酶，參與新表皮的形成[3-4].NAGase來源廣泛，在微生物、動(dòng)物和植物體內(nèi)均有存在[5-7]，且功能因物種種類或因分布位置不同而千差萬別，在水產(chǎn)動(dòng)物中同樣如此.如虹鱒精卵細(xì)胞中的NAGase活性可對(duì)受精率產(chǎn)生影響[8]；甲殼動(dòng)物中鋸緣青蟹內(nèi)表皮NAGase活力的變化趨勢(shì)表現(xiàn)出一定的季節(jié)性規(guī)律[9]；日本沼蝦NAGase已被證實(shí)與幼蝦蛻皮相關(guān)[10].

PUGNAc，全稱：O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino-N-phenylcarbamate，在1991年被證實(shí)為一種新型的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶抑制劑[11]，此后又被發(fā)現(xiàn)可抑制人體細(xì)胞中的O-GlcNAcase[12]，導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病和阿爾茨海默氏病等幾種疾病的發(fā)生，因此被廣泛應(yīng)用于各種生物和醫(yī)藥方面的研究[13-14]，但目前在魚類中應(yīng)用PUGNAc進(jìn)行NAGase的相關(guān)研究尚無報(bào)道.本試驗(yàn)以羅非魚肝臟NAGase為材料，研究PUGNAc對(duì)NAGase的抑制作用，旨在進(jìn)一步探究魚體內(nèi)該酶的生物學(xué)功能.

1 材料與方法

1.1 材料

底物對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAc)購于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；PUGNAc購于美國(guó)Sigma公司；其他無機(jī)試劑(AR級(jí)國(guó)產(chǎn)分析純)均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；使用的蒸餾水為雙蒸去離子水.

本試驗(yàn)中所用的NAGase系前期從尼羅羅非魚肝臟中采用硫酸銨(30%～70%)分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-200分子篩層析的方法分離純化所得，比活力為2 988 U·mg-1[15].

1.2 方法

酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]的方法.PUGNAc對(duì)酶的抑制機(jī)理和抑制類型的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]的方法.根據(jù)Tsou[18]的底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法研究PUGNAc對(duì)羅非魚肝臟NAGase的抑制作用：2 mL 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 5.7)的測(cè)酶活力體系，于37 ℃水浴5 min，加入20 μL酶液，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同底物濃度(0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1)和不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1)PUGNAc反應(yīng)體系的反應(yīng)過程.根據(jù)相應(yīng)的方程和做圖方法，分析底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線求得反應(yīng)速度常數(shù).

式中：E、S、I和P分別表示酶、底物、PUGNAc和產(chǎn)物；ES、EI和EIS則分別表示酶和底物結(jié)合的復(fù)合物、酶和PUGNAc結(jié)合的復(fù)合物以及酶、底物和PUGNAc結(jié)合的復(fù)合物.一般來說，當(dāng)?shù)孜餄舛?[S])?初始酶濃度([E0])以及PUGNAc濃度([I])?[E0]時(shí)，產(chǎn)物生成量的公式如下所示.

(1)

(2)

(3)

公式(1)～(3)中：[P]t表示反應(yīng)時(shí)間為t時(shí)的產(chǎn)物生成量；A和B分別表示表觀正向抑制速度常數(shù)和表觀反向抑制速度常數(shù)；v表示不存在PUGNAc時(shí)的初始反應(yīng)速度.根據(jù)米氏方程v=(Vm×[S])/(Km+[S])，當(dāng)t足夠大時(shí)，產(chǎn)物生成量曲線趨于直線，產(chǎn)物生成量([P]calc)的公式如下所示.

(4)

結(jié)合公式(1)和(4)，可得：

(5)

公式(5)中，[P]calc是通過公式(4)計(jì)算所得，為直線部分推斷出的產(chǎn)物量，而[P]t則是實(shí)際觀察得到的產(chǎn)物量.在不同濃度的PUGNAc溶液中，以ln([P]calc-[P]t)對(duì)t做圖得到一組斜率為-(A[I]+B)的直線.將以上所做圖中的直線斜率對(duì)[I]做圖得到一條直線，A和B可以通過該圖的截距和斜率求得.

結(jié)合公式(2)和米氏方程v=(Vm×[S])/(Km+[S])，得到：

(6)

2 結(jié)果與分析

2.1 PUGNAc對(duì)NAGase活力的影響

在磷酸鹽測(cè)活體系下，通過改變加入PUGNAc的濃度(0～2.0 μmol·L-1)來測(cè)定其對(duì)NAGase活力的影響.結(jié)果(圖1)顯示，體系中NAGase對(duì)底物的水解力隨著PUGNAc濃度的增大而降低，當(dāng)NAGase的相對(duì)活力降至50%時(shí)，PUGNAc的濃度為0.18 μmol·L-1.

2.2 PUGNAc對(duì)NAGase的抑制機(jī)理

不同PUGNAc濃度下NAGase活力與NAGase含量的關(guān)系如圖2所示.在不同的抑制劑濃度下，以NAGase剩余活力為縱坐標(biāo)，NAGase含量為橫坐標(biāo)，得到一組過原點(diǎn)的直線，直線斜率隨著抑制劑濃度的增大而逐漸減小.由此可知，抑制劑對(duì)NAGase的抑制作用是可逆的.PUGNAc的存在并沒有減少有效酶的量，只是抑制和減弱了酶活力.

圖1 不同濃度PUGNAc對(duì)NAGase活力的影響
Fig.1 Effects of different concentrations of PUGNAc on the activity of NAGase

0～4分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1PUGNAc磷酸鹽測(cè)活體系.
圖2 PUGNAc對(duì)NAGase的抑制機(jī)理
Fig.2 Inhibitory mechanism of PUGNAc on NAGase

2.3 PUGNAc對(duì)NAGase的抑制類型

底物磷酸鹽測(cè)活體系中，在抑制劑PUGNAc濃度變化的情況下，改變底物的量(0.10、0.15、0.20、0.25 mmol·L-1)，測(cè)得其光密度(D).通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法，得到一組交于第2象限且截距和斜率均不同的直線(圖3a).圖3a顯示，酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度Vm隨著抑制劑濃度的增大而變小，表明PUGNAc對(duì)NAGase的抑制類型屬于混合性抑制，推測(cè)PUGNAc可同時(shí)抑制游離酶以及酶—底物復(fù)合物的活性.圖3a中直線的斜率對(duì)抑制劑濃度做圖可得圖3b.通過圖3b中直線與截距求得PUGNAc與游離酶結(jié)合的抑制平衡常數(shù)KI為0.110 μmol·L-1.由圖3a中直線的截距對(duì)抑制劑濃度做圖可得圖3c.通過圖3c中直線與截距可以求得PUGNAc與酶—底物復(fù)合物結(jié)合的抑制平衡常數(shù)KIS為0.827 μmol·L-1.

2.4 PUGNAc對(duì)NAGase的抑制動(dòng)力學(xué)

2.4.1 不同PUGNAc濃度對(duì)NAGase的抑制動(dòng)力學(xué) 設(shè)置不同PUGNAc濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1)的磷酸鹽測(cè)活體系，以監(jiān)測(cè)NAGase水解底物pNP-NAG的產(chǎn)物量.圖4a顯示，底物濃度為0.3 mmol·L-1時(shí)，在不同濃度的PUGNAc作用下，該酶水解底物的速率隨著時(shí)間的增加不斷減慢直到趨于一條直線，且直線的斜率隨著PUGNAc濃度的增大而減小.用Tsou[18]的方法分析以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)加入PUGNAc后，酶水解底物的反應(yīng)是一個(gè)緩慢且可逆的過程.根據(jù)公式(6)，將ln([P]calc-[P]t)對(duì)t在不同PUGNAc濃度下做圖得到一組斜率為-(A[I]+B)的直線(圖4b).

2.4.2 不同底物濃度下PUGNAc對(duì)NAGase的抑制動(dòng)力學(xué) 在含有不同PUGNAc濃度(0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1)的溶液中，改變底物濃度，以檢測(cè)底物對(duì)酶水解底物的影響，結(jié)果如圖5a所示.圖5a顯示，當(dāng)t足夠長(zhǎng)時(shí)，v和虛線的斜率隨底物濃度的增大而增大.ln([P]calc-[P]t)對(duì)t在不同底物濃度下做圖，得到一組斜率為-(A[I]+B)的直線(圖5b).

2.5 NAGase微觀速率常數(shù)的計(jì)算

1～4：底物濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1.
圖6 ln([P]calc-[P]t)對(duì)t的直線圖的負(fù)斜率對(duì)[I]做圖
Fig.6 Secondary plots of the slopes against the concentration of PUGNAc

A來自圖6中直線的斜率.
圖7A/v對(duì)1/[S]做圖
Fig.7 Plot ofA/vversus 1/[S]

表1 PUGNAc對(duì)NAGase的微觀速率常數(shù)和抑制平衡常數(shù)Table 1 Inhibitory equilibrium constants and microscopic rate constants for NAGase in PUGNAc solution

3 討論

NAGase是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的重要水解酶，本課題組前期研究表明，羅非魚肝臟NAGase的比活力最高(肝臟為196.5 U·mg-1，腎臟為42.3 U·mg-1，精巢為36.3 U·mg-1，脾臟為12.6 U·mg-1，卵巢為6.1 U·mg-1).抑制劑對(duì)研究糖苷水解酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有極大的幫助[19].因此，本試驗(yàn)研究了N-乙酰己糖苷酶的抑制劑PUGNAc對(duì)羅非魚肝臟NAGase的抑制動(dòng)力學(xué)，為進(jìn)一步研究該酶的功能提供依據(jù).

本試驗(yàn)結(jié)果表明，PUGNAc可強(qiáng)烈抑制羅非魚肝臟NAGase的活性，IC50為0.18 μmol·L-1.Dong et al[20]研究得出，PUGNAc對(duì)鼠脾臟細(xì)胞質(zhì)中O-GlcNAcase的IC50為0.15 μmol·L-1.Meekrathok et al[21]在研究3種抑制劑(PUGNAc、NHAcCAS、NHAcDNJ)對(duì)哈維氏弧菌中GlcNAcase的劑量反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，PUGNAc抑制效果最好且具有最低的IC50(1.2 μmol·L-1).可見，抑制劑PUGNAc對(duì)鼠體內(nèi)該酶的IC50與本試驗(yàn)試驗(yàn)值較接近，但在細(xì)菌體內(nèi)該酶的IC50與本試驗(yàn)結(jié)果差距較大，初步猜測(cè)可能是動(dòng)物間NAGase的功能較動(dòng)物與微生物間的差距較小.

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，PUGNAc對(duì)NAGase的抑制機(jī)理是一種緩慢的可逆過程，抑制類型為混合性.PUGNAc對(duì)人體結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中O-GlcNAcase的抑制機(jī)理為可逆的，抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制[12]，與本試驗(yàn)結(jié)果相同.此外，甜菜堿和過氧化氫對(duì)南美白對(duì)蝦NAGase的抑制機(jī)理和抑制類型[22-23]也與本試驗(yàn)結(jié)果一致.

本試驗(yàn)為下一步進(jìn)行羅非魚肝臟NAGase的生物學(xué)功能研究提供依據(jù).