桃李細(xì)菌性穿孔病新病原的分離鑒定

童亞萍, 楊丙燁, 田 茜, 胡方平, 蔡學(xué)清

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

桃李細(xì)菌性穿孔病是核果類作物的主要病害之一，據(jù)報(bào)道，引起該病的病原菌僅為樹生黃單胞菌桃李致病變種(Xanthomonasarboricolapv.pruni)[1].

2015年至今，福建省古田縣的桃和李種植區(qū)細(xì)菌性穿孔病發(fā)生嚴(yán)重.作者對(duì)田間采集的發(fā)病葉片、果實(shí)和莖桿進(jìn)行病原分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)有65%以上的病斑均可分離到兩類不同形態(tài)特征的細(xì)菌菌落：一類菌落呈淡黃色、圓形隆起且黏稠；另一類菌落黃色、圓形扁平，不黏稠.煙草過敏性和致病性測(cè)定結(jié)果顯示，淡黃色黏稠的菌落有過敏反應(yīng)且致病性強(qiáng)，而黃色、扁平的菌落無過敏反應(yīng)但能致病，致病性較弱.經(jīng)鑒定，前者為已報(bào)道的桃李細(xì)菌性穿孔病的病原菌——樹生黃單胞菌桃李致病變種，而后者疑似為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans).Burr et al[2]研究表明,成團(tuán)泛菌能在石竹花和甜菜上引起菌癭；Tho et al[3]發(fā)現(xiàn)該菌能引起洋蔥葉枯萎病和鱗莖腐爛病，并且在某些地區(qū)發(fā)病率達(dá)80%以上；Guadalupe et al[4]發(fā)現(xiàn)成團(tuán)泛菌能使玉米和高粱的葉片和維管束枯萎；洪永聰?shù)萚5]和謝關(guān)林等[6]研究表明，成團(tuán)泛菌能影響稻谷的灌漿與發(fā)育；Medrano et al[7]和劉雅琴等[8]發(fā)現(xiàn)成團(tuán)泛菌可以侵染不同品種的棉花,造成爛鈴??；Yang et al[9]研究表明,成團(tuán)泛菌是引起核桃褐色頂端壞死病的主要病原菌之一.但目前尚未見成團(tuán)泛菌引起桃李細(xì)菌性穿孔病的報(bào)道.本試驗(yàn)就分離得到的細(xì)菌對(duì)桃和李的致病性及其分類地位進(jìn)行研究，為深入了解該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

表1 供試菌株Table 1 Strains tested in this study

1.1.1 供試菌株 供試的30株細(xì)菌菌株是從福建省古田縣采集的白鳳桃、芙蓉李病葉、病果和病莖桿上分離、純化獲得(表1).對(duì)照菌株H11(P.agglomerans)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)高潔教授惠贈(zèng)，Li20(X.arboricolapv.pruni)從福建省古田縣芙蓉李病果上分離并保存.

1.1.2 供試植物 白鳳桃和芙蓉李苗購(gòu)自福建古田縣科委名優(yōu)水果場(chǎng)，種植在溫室盆缽中，備用.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 采用平板劃線分離法[10]對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化.

1.2.2 煙草過敏性反應(yīng)測(cè)定 參照方中達(dá)[10]的方法，將細(xì)菌懸浮液(D600 nm=0.8)注射在煙草葉片的細(xì)胞間，觀察注射點(diǎn)周圍是否出現(xiàn)過敏性枯斑.

1.2.3 致病性測(cè)定 采用噴霧接種的方法，菌液接種濃度為D600 nm=0.8，每個(gè)供試菌株噴霧接種3個(gè)枝條，每個(gè)枝條葉片數(shù)平均約為20片，以每片葉的正反面均噴濕為準(zhǔn)，套袋保濕24 h，第2天開始觀察并記錄發(fā)病情況.以噴霧接種黃單胞菌Li20菌株、Li20和Ly8混合菌懸浮液為陽(yáng)性對(duì)照，以接種無菌水為陰性對(duì)照.對(duì)接種后發(fā)病的病斑再進(jìn)行病原菌的分離與純化.

1.2.4 革蘭氏染色 采用結(jié)晶紫草酸銨染色法進(jìn)行測(cè)定.

1.2.5 電鏡測(cè)定 采用磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行染色并在透射電子顯微鏡(Hitachi HT7700)下觀察.

1.2.6 生理生化特性測(cè)定 運(yùn)動(dòng)性、好氧與厭氧性，海藻糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、丙三醇、葡萄糖、丙二酸鹽和檸檬酸鹽的利用，以及蔗糖還原、七葉靈水解、硝酸還原、硫化氫(H2S)的產(chǎn)生、吲哚的產(chǎn)生、明膠水解、淀粉水解參照方中達(dá)[10]的方法；在YDC培養(yǎng)基上色素的產(chǎn)生參照Schaad et al[11]的方法；苯丙氨酸脫氨酶的產(chǎn)生參照洪永聰[12]的方法.以H11為對(duì)照菌株.

1.2.7 Biolog測(cè)定 采用Gen Ⅲ Microstation biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定.

1.2.8 分子生物學(xué)鑒定 16S rDNA基因鑒定參照Moreno et al[13]的方法；fusA、gyrB、leuS、pyrG、rpoB、rlpB等6個(gè)看家基因的多位點(diǎn)序列分析(multi-locus sequence analysis, MLSA)參照Deletoile et al[14]的方法.用貝葉斯法構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，MLSA采用最大似然法.

2 結(jié)果與分析

2.1 病害的田間癥狀

桃樹葉片上呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則形的紫褐色或黑褐色病斑，周圍有明顯黃色暈圈(圖1A)，而李樹的葉片上病斑多數(shù)發(fā)生在葉脈附近(圖2A、2B)，病斑后期脫落會(huì)形成穿孔.果實(shí)上呈現(xiàn)黑色或黑褐色圓形病斑，后期凹陷，桃果實(shí)上的病斑易干裂(圖1B)，而李果實(shí)上的病斑周圍水漬狀明顯，無開裂(圖2C).另外，李樹莖桿上會(huì)形成褐色條狀壞死斑，嚴(yán)重時(shí)樹皮開裂(圖2D).

2.2 菌落形態(tài)

供試菌株在NA平板上培養(yǎng)1～2 d的菌落呈黃色、圓形，透亮潤(rùn)澤；培養(yǎng)3～5 d后，菌落變扁平，且周圍開始分泌白色易流動(dòng)物質(zhì)(圖3A).在KB平板上生長(zhǎng)的菌落呈明黃色(圖3B).

2.3 煙草過敏性反應(yīng)和致病性測(cè)定結(jié)果

30株供試菌株均無煙草過敏性壞死反應(yīng).2015—2019年，桃和李單獨(dú)接種供試菌株后所表現(xiàn)的癥狀(圖4A、4E-F)均與田間發(fā)生的癥狀、單獨(dú)接種樹生黃單胞菌后所表現(xiàn)的癥狀(圖4B、4G)以及混合接種供試菌株和樹生黃單胞菌后所表現(xiàn)的癥狀(圖4C、4H)相同.桃和李葉片噴霧接種供試菌株2～3 d后均出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形的褪綠色水漬狀病斑，隨后病斑變紅褐色或褐色，周圍有明顯黃色暈圈，病斑多出現(xiàn)在桃葉的葉緣和葉中(圖4A)以及李葉的葉緣和葉脈上(圖4E-F)，發(fā)病后期均造成葉片的穿孔和脫落.從接種后發(fā)病的病斑上又重新分離獲得了菌落形態(tài)特征相同的菌株，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，這30株菌株均可對(duì)桃和李致病.

2.4 細(xì)菌鑒定

2.4.1 細(xì)菌的形態(tài)特征 供試菌株的菌體呈短桿狀，大小為(1.8～2.7) μm×(0.9～1.3) μm，兩端鈍圓；革蘭氏染色呈陰性，周生2～4根鞭毛(圖5).

2.4.2 生理生化特性 供試菌株在YDC培養(yǎng)基上不產(chǎn)生褐色素，兼性厭氧，可利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，具運(yùn)動(dòng)性，可利用阿拉伯糖、丙三醇、甘露醇、海藻糖和山梨醇；七葉靈水解、檸檬酸鹽和丙二酸鹽的利用、吲哚的產(chǎn)生、H2S的產(chǎn)生和明膠液化測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性，蔗糖還原、淀粉水解及卵磷脂酶、苯丙氨酸脫氨酶和硝酸還原測(cè)定結(jié)果為陰性.與對(duì)照菌株H11的測(cè)定結(jié)果一致.供試菌株被初步鑒定為P.agglomerans.

2.4.3 Biolog測(cè)定 從2.4.2可知，30株菌株的19項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)試結(jié)果均一致，因此，隨機(jī)挑選6株菌株進(jìn)行71種碳源利用及23種化學(xué)敏感性測(cè)試.培育48 h后經(jīng)Microlog軟件讀數(shù)，結(jié)果顯示6株菌株均與數(shù)據(jù)庫(kù)中P.agglomerans的相似度最高(表2).

2.4.4 16S rDNA基因鑒定結(jié)果 利用16S rDNA基因的通用引物27F/1492R對(duì)4株供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上在線比對(duì)顯示，供試菌株與P.agglomerans的16S rDNA基因序列的相似性達(dá)99%.

Mrbayes上采用GTR+G+I模型，以大腸桿菌(EscherichiacoliT)為外群，并下載成團(tuán)泛菌(P.agglomeransT)、菠蘿泛菌(P.ananatisT)、分散泛菌(P.dispersaT)、斯氏泛菌(P.stewartiiT)、檸檬泛菌(P.citreaT)、斑點(diǎn)泛菌(P.punctataT)、瓦氏泛菌(P.vagansT)(=P.agglomerans)、土壤塔特姆菌(TatumellaterreaT)(=土壤泛菌P.terrea)、解淀粉歐文氏菌(ErwiniaamylovoraT)、E.toletanaT(=P.toletana)、蚜蟲歐文氏菌(E.aphidicolaT)為參比序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6).結(jié)果顯示，菌株T18、Ly8與P.agglomerans聚在一起，菌株Ly13、Ly16在泛菌屬的分支中，與Erwinia的3個(gè)種和Escherichiacoil區(qū)分開.

表2 供試菌株的Biolog測(cè)定結(jié)果Table 2 Biolog results of the strains tested

2.4.5 MLSA結(jié)果 用看家基因fusA、gyrB、leuS、pyrG、rpoB和rlpB進(jìn)行多基因串聯(lián)建樹，以胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)為外群，并在NCBI上下載成團(tuán)泛菌(P.agglomeransT)以及與成團(tuán)泛菌親緣關(guān)系密切的菠蘿泛菌(P.ananatisT)、分散泛菌(P.dispersaT)和斯氏泛菌(P.stewartiiT)作為參比序列，用GTR+I+G模型，在MAGE 5軟件上采用最大似然法建樹(圖7).結(jié)果顯示，供試菌株與H11以及P.agglomerans模式菌株聚在一起.

3 討論與結(jié)論

成團(tuán)泛菌廣泛存在于大自然中，通常被認(rèn)為是一種腐生菌或次生菌.但近年來研究發(fā)現(xiàn)成團(tuán)泛菌可使多種植物發(fā)病，有些被確定為植物病害的病原菌[2-6]，有些被認(rèn)為是植物病害的機(jī)會(huì)致病菌[7]，還有些被認(rèn)為是伴生病原菌[15].作者從福建省古田縣采集的桃李細(xì)菌性穿孔病的標(biāo)本中，有65%以上的病斑均能分離到樹生黃單胞菌桃李致病變種和成團(tuán)泛菌2種細(xì)菌，將2種細(xì)菌菌株分別單獨(dú)接種或混合接種于桃和李葉片均能造成與田間相似的癥狀.因此認(rèn)為成團(tuán)泛菌是桃李細(xì)菌性穿孔病的新病原.

本研究通過16S rDNA基因分析仍無法將供試的30株菌株準(zhǔn)確劃分到種.Deletoile et al[14]研究表明，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB、rpoB等6個(gè)看家基因的MLSA可以很好地將泛菌屬的P.agglomerans、P.ananatis、P.dispersa、P.stewartii、P.citrea、P.punctata和P.terrea等7個(gè)種區(qū)分開.因此，本研究通過這6個(gè)看家基因聯(lián)合建樹，結(jié)果表明，供試的30株菌株均與成團(tuán)泛菌聚在一支.結(jié)合傳統(tǒng)的生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終將分離獲得的30株細(xì)菌菌株鑒定為成團(tuán)泛菌(P.agglomerans).

成團(tuán)泛菌作為桃李細(xì)菌性穿孔病的病原菌之一，與已報(bào)道的樹生黃單胞菌之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究.此外，有研究表明，成團(tuán)泛菌可通過水平基因轉(zhuǎn)移獲取其他病原菌的一種包含致病島的質(zhì)粒，從而演變成寄主專化型的致病菌[16].本研究獲得的成團(tuán)泛菌，其致病性是該菌原本就具備還是從樹生黃單胞菌上獲取了某些致病基因，仍需要進(jìn)一步探究.