雌二醇通過上調(diào)IRE1α-XBP1信號(hào)軸抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分化

雌激素是人體內(nèi)重要的激素之一，不僅在女性第二性征的發(fā)育中起重要作用，而且在維持體內(nèi)免疫環(huán)境的平衡起著重要作用，其對(duì)免疫細(xì)胞的影響也越來(lái)越引起人們的關(guān)注。巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞的重要組成部分，在體液免疫和細(xì)胞免疫的進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要分為促炎的M1型和抗炎的M2型，M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)一氧化氮合酶和腫瘤壞死因子等促炎介質(zhì)，在體內(nèi)能夠引起炎癥反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-10和精氨酸酶1，在組織修復(fù)和抑制炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮積極作用。有研究顯示雌激素會(huì)引起巨噬細(xì)胞表型的分化，但其內(nèi)在的作用機(jī)制尚缺乏文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指在組織缺氧、損傷、炎癥等環(huán)境下，細(xì)胞為了緩解壓力以及恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，產(chǎn)生的一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，已有研究證實(shí)其在巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，也有研究者發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用，這些研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在巨噬細(xì)胞極化及發(fā)揮生物功能上發(fā)揮了重要作用。作為巨噬細(xì)胞分化及免疫功能研究方面的兩個(gè)熱點(diǎn)，雌激素和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激兩者在巨噬細(xì)胞分化中起到何種作用呢？?jī)烧呤欠裣嗷ヂ?lián)系？目前國(guó)內(nèi)外對(duì)此研究較少，其中的機(jī)制及聯(lián)系尚不明確。本研究旨在探討雌激素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑影響巨噬細(xì)胞極化的可能機(jī)制。

（1）績(jī)效理念有待牢固樹立。部分預(yù)算單位對(duì)預(yù)算績(jī)效管理和評(píng)價(jià)工作還不甚了解，對(duì)績(jī)效工作重視不夠，沒有將工作重點(diǎn)放在項(xiàng)目資金使用效益和效果方面，項(xiàng)目績(jī)效管理工作存在被動(dòng)應(yīng)付現(xiàn)象，工作缺乏主動(dòng)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6J小鼠，8～10周齡，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0167，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。所有動(dòng)物處理和程序均經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)（L2016068）

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基（Hycolone，SH30022.01），胎牛血清（FBS，Gibco，10099-141），青-鏈霉素溶液（Gibco，15140-122），RAPI 蛋白裂解液（碧云天，P0013C），PMSF（碧云天，ST506），雌二醇（Sigma，E2758），雌激素受體拮抗劑(MCE,HY-16023A），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Theromfish，K1622），SYBR 熒光定量PCR 試劑盒（Theromfish，11762500），5×loadding buffer（弗德，F(xiàn)D002），PVDF膜（默克，32031613），ECL顯影試劑盒（弗德，F(xiàn)D8000），IRE1α抗體（novas，NB100-2324），p-IRE1α抗體（novas，NB100-2323），eIF2α抗體（abcam，ab5369），P-eIF2α抗體（abcam，ab32157），ATF6 抗體（novas，NBP1-40256），IRE1α激動(dòng)劑TG（Santa Cruz，67526-95-8），IRE1α抑制劑4μ8 C（MCK,HY-19707）。實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Stepone plus），流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACS Calibur）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定 胰酶消化巨噬細(xì)胞，10%胎牛血清（FBS）完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞至10，加入PE-F4/80抗體，室溫避光孵育15 min，加入PBS重懸清洗，1000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，100μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

總而言之，初中道德與法治對(duì)學(xué)生未來(lái)的生活和發(fā)展起著重要的作用，不僅有利與他們養(yǎng)成良好的行為習(xí)慣，還能使其提高法律意識(shí)，從而為將來(lái)的發(fā)展打下良好的基礎(chǔ)。

1.3.1 小鼠巨噬細(xì)胞分離 小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5 min，10 mL無(wú)菌注射器吸取5 mL培養(yǎng)基，小心的注射到小鼠腹腔中，按摩小鼠腹部2～3 min，剪開腹部淺層皮膚，無(wú)菌注射器吸取腹腔液于離心管中，500 g離心5 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗2次，隨后接種到培養(yǎng)皿中37 ℃培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.3.2 細(xì)胞分組 細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h后，0.25%的胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化后以1×10孔，接種到6孔板中，分別給予雌激素（1 nmol/L）、雌激素（1 nmol/L）+雌激素受體拮抗劑（4 nmol/L），雌激素（1 nmol/L）+IRE1α抑制劑（50μmol/L）、IRE1α激動(dòng)劑（0.2 nmol/L）處理，空白對(duì)照組加等量PBS處理，隨后正常培養(yǎng)。

1.2.2 5'缺失表達(dá)載體的構(gòu)建 將各片段TA克隆至pMD19-T載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，培養(yǎng)12～16 h后挑單克隆，PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序得到準(zhǔn)確的質(zhì)粒。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至48 h后，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS沖洗2次，每孔加入1 mLTrizol試劑，充分裂解細(xì)胞，按照說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。后續(xù)cDNA產(chǎn)物通過SYBR試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（表1）。

1.3.4 免疫熒光鑒定巨噬細(xì)胞 將巨噬細(xì)胞接種到爬片上，培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗2次，加入PE-F4/80抗體，室溫避光孵育15 min，加入PBS重懸清洗2次，在載玻片上滴加DAPI封片劑，將爬片倒扣于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 蛋白印跡分析檢測(cè)配制蛋白裂解液，1 mL RAPI裂解液加入10μL 100 mmol/L蛋白酶-磷酸酶抑制劑和10μL 100 nmol/L的PMSF。細(xì)胞培養(yǎng)至48 h后，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS沖洗2次，每孔加入300μL配制好的裂解液，冰上裂解30 min充分裂解細(xì)胞，吸取細(xì)胞勻漿于潔凈的EP管中，4 ℃14 000 r/min離心15 min，小心的吸取上清加入5×Loadding buffer，煮沸變性5 min。制備10%分離膠，5%濃縮膠，80～120 V電泳，PVDF膜90 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉封閉30 min，加入一抗稀釋液配制的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗5 min×3次，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST清洗5 min×3次，ECL顯影液顯影曝光，ImagJ軟件分析條帶灰度值。

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析以及獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次以上重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)合擬建工程規(guī)劃方案構(gòu)想、方案設(shè)計(jì)原則、主要設(shè)備參數(shù)、工程建設(shè)條件等，制定技術(shù)方案相近或一致的通用造價(jià)技術(shù)方案，可直接將通用造價(jià)視為工程的基礎(chǔ)造價(jià)，后結(jié)合工程建設(shè)具體情況增加基于特殊費(fèi)用而形成的新建工程整體工程造價(jià)。這種直接應(yīng)用的方式較為簡(jiǎn)單，但需要注意的問題是，要對(duì)電網(wǎng)基礎(chǔ)建設(shè)項(xiàng)目的投資構(gòu)成與方案應(yīng)用的可行性進(jìn)行綜合分析[2]。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞的流式鑒定。

免疫熒光對(duì)F4/80染色的巨噬細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示分離出的細(xì)胞主要為F4/80細(xì)胞（圖1A）。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞純度進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果顯示F4/80細(xì)胞率達(dá)98.8%（圖1B）。

2.2 雌激素對(duì)炎癥條件下巨噬細(xì)胞極化的影響

同時(shí)存在雌激素和IRE1α抑制劑時(shí)，巨噬細(xì)胞M1相關(guān)蛋白MHC-II（=0.002）和iNOS（=0.003）表達(dá)顯著上調(diào)，促炎細(xì)胞因子TNF-α（=0.003）和IL-6 mRNA（=0.024）表達(dá)上調(diào)，抗炎的M2型細(xì)胞因子TGF-β（＜0.001）和IL-10（＜0.001）mRNA 表達(dá)下調(diào)，而激動(dòng)IRE1α通路會(huì)矯正這種變化，同時(shí)給予雌激素并激動(dòng)IREα?xí)?dǎo)致類似的變化（圖4）。

2.3 雌激素對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，雌激素處理后IRE1α信號(hào)顯著激活（＜0.001），加入雌激素受體拮抗劑中斷雌激素信號(hào)后，其活化被抑制，而其它兩條信號(hào)ATF6（=0.986）和eIF2α（=0.975）沒有顯著變化（圖3A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析同樣發(fā)現(xiàn)刺激處理后巨噬細(xì)胞的IRE1α下游XBP1（＜0.001）顯著上調(diào)，而雌激素受體抑制劑能夠抑制其上調(diào)，另外兩條通路ATF6（=0.985）和eIF2α（=0.976）無(wú)顯著變化（圖3B）。

2.4 雌激素通過IRE1α通路對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，雌激素處理抑制巨噬細(xì)胞促炎相關(guān)蛋白MHC-II（=0.021）和iNOS（＜0.001）的表達(dá)，加入雌激素受體拮抗劑中斷雌激素信號(hào)后，這種抑制作用顯著被矯正（圖2A）。對(duì)3組巨噬細(xì)胞總RNA進(jìn)行定量分析，同樣發(fā)現(xiàn)雌激素處理后促炎的TNF-α（=0.003）、IL-6（=0.004）表達(dá)下調(diào)，而TGF-β（=0.002）、IL-10（=0.008）等抑炎分子表達(dá)上調(diào)，而雌激素受體阻斷劑能夠矯正這種變化（圖2B）。

3 討論

雌激素是類固醇激素，具有廣泛的生理功能。其存在主要有三種形式：雌二醇、雌酮和雌三醇，其中以雌二醇為主。有研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)雌激素能夠和雌激素受體結(jié)合，在調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育、心血管系統(tǒng)保護(hù)和體內(nèi)平衡中起著重要作用。雌激素能夠通過和免疫細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合，調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖和分化，并最終影響免疫細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。在局部炎癥反應(yīng)中，雌激素能夠刺激漿細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，直接上調(diào)B細(xì)胞活化分子CD22、SHP-1和Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)B 細(xì)胞凋亡分子PD-1 的表達(dá)。除此之外，雌激素能夠通過增加調(diào)節(jié)T細(xì)胞的數(shù)量和占比，由此對(duì)先天免疫產(chǎn)生抑制作用，調(diào)控T細(xì)胞中趨化因子受體的表達(dá)，進(jìn)而抑制單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的分泌，調(diào)控自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響損傷組織的炎癥進(jìn)程。而在炎癥反應(yīng)過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮了重要作用。雖然雌激素在免疫方面的研究較多，但是關(guān)于雌激素對(duì)巨噬細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

在本研究中，我們首先通過體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并在炎癥環(huán)境下給予雌激素處理，發(fā)現(xiàn)雌激素能夠下調(diào)巨噬細(xì)胞向促炎表型的分化，為了驗(yàn)證這一變化是由雌激素通路引起的，我們添加了雌激素受體抑制劑做對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的分化變化得到了矯正。有學(xué)者研究顯示雌激素在調(diào)節(jié)癌癥患者癌變部位未折疊蛋白反應(yīng)中起到重要作用，而未折疊蛋白反應(yīng)是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要信號(hào)。那么雌激素影響巨噬細(xì)胞的分化是否和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在某種聯(lián)系呢？?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后主要通過UPR下游的ATF6、IRE1α、eIF2α三條主要的信號(hào)通路調(diào)節(jié)免疫過程。

為了驗(yàn)證我們的假設(shè)我們檢測(cè)了雌激素處理后巨噬細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白ATF6、IRE1α、eIF2α的變化情況，結(jié)果顯示IRE1α的活化及其下游功能分子XBP1s的轉(zhuǎn)錄與雌激素密切相關(guān)。IRE1α及其下游的XBP1在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成和釋放中起著重要作用，最新的研究發(fā)現(xiàn)XBP1 能夠促進(jìn)了NF-κB 的激活，進(jìn)而引起主要在巨噬細(xì)胞中的炎癥細(xì)胞因子的釋放。根據(jù)之前的報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)主要參與促炎作用。然而，我們發(fā)現(xiàn)IRE1α抑制導(dǎo)致IFN-γ處理的巨噬細(xì)胞促炎分化，這一觀點(diǎn)與最近發(fā)現(xiàn)的ER應(yīng)激負(fù)調(diào)節(jié)干擾素引起的先天免疫相一致。這可能和雌激素作用存在某種關(guān)聯(lián)性。那么雌激素調(diào)控的巨噬細(xì)胞的分化是否與IRE1α信號(hào)的變化有直接聯(lián)系呢？為探究這一問題，我們對(duì)巨噬細(xì)胞在給予雌激素作用的同時(shí)抑制IRE1α通路隨后對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行蛋白水平和基因水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)通過抑制IRE1α信號(hào)能夠矯正巨噬細(xì)胞受雌激素影響導(dǎo)致的促炎分化的抑制情況，而直接激活I(lǐng)RE1α信號(hào)同樣能夠抑制巨噬細(xì)胞的促炎分化。這提示我們雌激素對(duì)巨噬細(xì)胞促炎癥表型分化的抑制作用有可能是通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的IRE1α-XBP1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，這與學(xué)者發(fā)現(xiàn)的IRE1α-XBP1能夠在M2型巨噬細(xì)胞上表達(dá)激活的結(jié)論相輔相成。

(3)引人入勝，探索未知帶來(lái)愉悅.在生成性課堂中，學(xué)生有著充足的空間去探索，在這一過程中，他們會(huì)遇到許多新問題，產(chǎn)生許多新想法，遇到許多新困難，生成性課堂給了學(xué)生進(jìn)一步探索的機(jī)會(huì)，滿足了其探索的欲望.

綜上所述，本研究闡釋了雌激素通過激活I(lǐng)RE1α-XBP1信號(hào)抑制巨噬細(xì)胞的促炎分化的可能機(jī)制，為雌激素對(duì)巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)的治療提供新的治療策略和理論基礎(chǔ)。