粉防己堿對人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株S0-Rb50增殖凋亡影響的可能機制研究

馬高恩 焦云娟 賀 琳 劉向玲

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是臨床常見嬰幼兒眼內(nèi)惡性腫瘤之一，每年新發(fā)例數(shù)約占嬰幼兒惡性腫瘤總例數(shù)的3%，早期及時、有效治療生存率高，若延誤治療時機，病灶擴展至眼外，則可能造成低視癥和眼盲，甚至死亡，對患兒家庭造成嚴重影響[1]。目前，RB臨床治療主要包括外科手術輔助放化療等，但由于外科手術侵襲性強，放化療不良反應較大，且易出現(xiàn)化療藥物耐藥性等問題，臨床治療效果不理想[2]。因此，尋找安全、有效的抗RB藥物仍是臨床研究的重點。粉防己堿(tetrandrine，Tet)是從天然植物中提取的一種生物堿，研究發(fā)現(xiàn)，Tet除具有解熱鎮(zhèn)痛、血管擴張、抗菌消炎等藥理學作用外，其在抗腫瘤方面也具有潛在應用價值[3,4]。已有研究證實，Tet具有抗乳腺癌作用，但關于其對人RB增殖及凋亡影響的研究仍較少[5]。本研究設計體外實驗，通過檢測不同濃度Tet對人RB細胞株S0-Rb50增殖及凋亡的影響，并進一步探討其作用機制，為Tet在RB臨床治療中的應用提供參考。

材料與方法

1.材料：人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株S0-Rb50購自中國科學院上海細胞庫。粉防己堿(Tet，美國Sigma-Aldrich公司，純度≥90%)，RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國Hyclone公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo公司)，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated，pAkt)、B淋巴細胞瘤-2基因(B lymphocyte tumor-2 gene，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)、裂解的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)一抗及二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒(美國BD公司)；VersaMAX型酶標儀(美國Molecular Dvices公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，電泳儀、Tanon 5200化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2.細胞培養(yǎng)、干預及形態(tài)學觀察：人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株S0-Rb50培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清、1%青鏈霉素)、37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，取對數(shù)期生長細胞，調(diào)整細胞密度，以1.5×105個/毫升接種于96孔板，隨機分為4組，即對照組、Tet低、中、高劑量組，每組5個復孔；待細胞重新貼壁生長至80%時，分別更換濃度為0、2.5、5.0、10.0μmol/L Tet細胞培養(yǎng)液，干預24h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

3.MTT法檢測各組細胞增殖情況：取干預24、48、72h時各組細胞，加入5mg/ml的新鮮制備的四唑鹽(tetrazolium salt，MTT)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上層培養(yǎng)液，加入DMSO 150μl，充分震蕩至澄清，測定570nm處吸光度(optical density，A)值。

4.流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡情況：取干預24h時各組細胞，預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)洗滌細胞2次，2000r/min離心8min，棄去上清后加入1.0ml碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻室溫靜置15min，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況。取干預24h時各組細胞，計數(shù)1×106個細胞與0.5ml上樣緩沖液、5μl Annexin V-FITC、5μl PI充分混勻，避光孵育15min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。

5.實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測蛋白表達情況：取干預24h時各組細胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，應用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行RT-qPCR擴增，按照試劑盒說明書設定反應體系，反應條件為95℃預變性32min；95℃變性20s，57℃退火40s，72℃延伸40s，重復42個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT為目的基因的相對表達強度，計算PI3K、Akt、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量。引物序列詳見表1。

6.Western blot法檢測蛋白表達情況：取干預24h時各組細胞，加入細胞裂解液，震蕩混勻后4℃、12000r/min離心10min，收集上清液進行BCA蛋白定量，取15μg與等量上樣緩沖液混勻后沸水浴5min，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，封閉液常溫封閉2h，加入一抗4℃搖床孵育過夜，洗膜后加入對應二抗常溫孵育1h，洗膜后進行曝光和顯影；應用灰度值分析軟件進行掃描拍照，以PI3K、pAkt、Akt、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

表1 引物序列

結(jié) 果

1.各組細胞形態(tài)學觀察：倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞形態(tài)規(guī)則、融合成片，不同干預組細胞隨Tet濃度升高細胞體積逐漸減小、核質(zhì)比例減小，不能融合成片，視野內(nèi)漂浮細胞或細胞崩解碎片增多，詳見圖1。

2.各組MTT試驗A值比較：各時刻MTT試驗A值組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet高劑量組干預24h時A值較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Tet各劑量組干預48、72h時A值均較低，且隨干預劑量升高呈降低趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組MTT試驗A值隨干預時間的延長呈升高趨勢(P<0.05)，Tet高劑量組MTT試驗A值隨干預時間的延長無明顯變化(P>0.05)，詳見表2。

3.各組細胞周期分布情況比較：G0/G1、S、G2/M期細胞占比組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet各劑量組G0/G1、S期細胞占比較低，G2/M期細胞占比較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組G0/G1、S期細胞占比較低，G2/M期細胞占比較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組G0/G1、S期細胞占比較低，G2/M期細胞占比較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表3。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學(×400)A.對照組；B.Tet低劑量組；C.Tet中劑量組；D.Tet高劑量組

表2 各組MTT試驗A值比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05；與本組內(nèi)24h比較，▲P<0.05；與本組內(nèi)48h比較，&P<0.05

表3 各組細胞周期分布情況比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

4.各組細胞凋亡率比較：細胞凋亡率組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet各劑量組細胞凋亡率較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組細胞凋亡率較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組細胞凋亡率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表4、圖2。

表4 各組細胞凋亡率比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

5.PI3K、Akt、Bcl-2、Bax mRNA表達量比較：PI3K、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet各劑量組PI3K、Bcl-2 mRNA相對表達量較低，Bax mRNA相對表達量較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組PI3K、Bcl-2 mRNA相對表達量較低，Bax mRNA相對表達量較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組PI3K、Bcl-2 mRNA相對表達量較低，Bax mRNA相對表達量較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表5。

6.PI3K、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達量及pAkt/Akt比較：PI3K、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達量及pAkt/Akt組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 與對照組比較，Tet各劑量組PI3K、Bcl-2蛋白相對表達量及pAkt/Akt較低，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達量較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組PI3K、Bcl-2蛋白相對表達量及pAkt/Akt較低，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達量較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組PI3K、Bcl-2蛋白相對表達量及pAkt/Akt較低，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達量較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表6、圖3。

圖2 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡情況A.對照組；B.Tet低劑量組；C.Tet中劑量組；D.Tet高劑量組

表5 PI3K、Akt、Bcl-2、Bax mRNA表達量比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

表6 PI3K、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達量及pAkt/Akt比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

圖3 Western blot法檢測蛋白表達情況A.對照組；B.Tet低劑量組；C.Tet中劑量組；D.Tet高劑量組

討 論

RB是人類特有的一種眼內(nèi)惡性腫瘤，多發(fā)生于出生后7～24個月，對患兒的視力和生命造成嚴重危害[6]。為提高患兒的生存質(zhì)量，臨床治療主要趨勢為避免眼球摘除、放療等侵襲性強的治療手段，盡量保留患兒視力，因此，尋找有效藥物及靶向作用通路有重要意義。RB主要包括遺傳性生殖細胞突變、非遺傳性視網(wǎng)膜細胞突變兩種類型，其發(fā)生和發(fā)展過程復雜，影響因素多樣，目前仍未完全闡明，主要涉及癌基因激活、增殖失控及凋亡機制異常等[7,8]。因此，抑制RB細胞增殖、促進其凋亡是控制病情進展的關鍵。

Tet屬于雙芐基異喹啉堿，是從粉防己、防己等常用中草藥植物根中提取的有效成分。研究表明，Tet對骨關節(jié)炎、支氣管哮喘、神經(jīng)母細胞瘤均有良好抑制作用[9～11]。張美峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可有效抑制人甲狀腺癌細胞B-CPAP增殖、促進凋亡作用，且具有明顯劑量依賴和時間依賴性，與本研究結(jié)果相似。本研究通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同劑量Tet干預后各組細胞生長受到抑制，且呈現(xiàn)體積逐漸減小、核質(zhì)比例減小、漂浮細胞或細胞崩解碎片增多等不良生長狀態(tài)。通過MTT試驗發(fā)現(xiàn)，Tet各劑量組干預不同時刻A值均明顯降低，呈劑量依賴和時間依賴性，說明Tet可有效抑制S0-Rb50增殖。另外，本研究經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，Tet干預24h后G0/G1、S期細胞占比均降低，G2/M期細胞占比、凋亡率均升高，且均具有劑量依賴性，提示Tet可抑制S0-Rb50增殖、促進凋亡，其中10.0μmol/L Tet干預效果最佳。由此，Tet對人RB細胞S0-Rb50具有增殖抑制和凋亡促進作用，可以看出Tet在RB治療中療效可觀，為更多臨床試驗的開展提供參考。

癌細胞增殖、凋亡過程涉及多條信號通路共同調(diào)控，通過調(diào)節(jié)信號通路進而影響細胞內(nèi)相關基因的表達，可間接發(fā)揮調(diào)控癌細胞增殖及凋亡過程[13]。PI3K是由調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位組成的異源二聚體，當胞外信號激活PI3K后，可使其下游效應分子Akt發(fā)生膜轉(zhuǎn)位而磷酸化激活，Akt磷酸化進入細胞內(nèi)進而調(diào)節(jié)其下游靶基因表達，參與調(diào)控細胞增殖過程[14，15]。PI3K/Akt信號通路激活后，可促進其下游Bcl-2與Bax蛋白呈游離狀態(tài)，分布于線粒體內(nèi)的Bcl-2可抑制細胞色素C釋放，進而抑制caspase-3活化，發(fā)揮凋亡抑制作用，而Bax可通過活化死亡效應級聯(lián)反應而促進凋亡進程[16,17]。本研究中Tet各劑量組干預24h后PI3K、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量及pAkt/Akt均降低，Bax mRNA和蛋白、cleaved caspase-3蛋白相對表達量均升高，且均具有劑量依賴和時間依賴性，提示Tet可能通過抑制PI3K/Akt信號通路、下調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白、上調(diào)Bax mRNA和蛋白及cleaved caspase-3蛋白表達發(fā)揮抑制S0-Rb50細胞增殖、促進凋亡作用，可以看出Tet具有靶向作用于PI3K/Akt信號通路進而影響其抗腫瘤效果，為臨床應用Tet進行靶向治療RB提供參考依據(jù)。

綜上所述，Tet可抑制人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株S0-Rb50增殖，促進凋亡，其中10.0μmol/L Tet干預效果最佳，可能與抑制PI3K/Akt信號通路及其下游相關基因和蛋白的表達相關，在進一步的研究中應探討Tet是否存在其他調(diào)控通路發(fā)揮增殖抑制和凋亡促進作用。本研究從體外水平驗證了Tet抗視網(wǎng)膜母細胞瘤作用，為臨床前試驗的開展提供參考，同時為Tet相關藥物的研發(fā)及應用于臨床視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療提供數(shù)據(jù)支持。