基于宏基因組二代測序技術的兒童重癥腺病毒7型肺炎20例病例系列報告

張 甜 陳名武, 張曉光 朱昂昂 王倩文

人腺病毒(HAdV)是引起兒童呼吸道感染的重要病原體，流行病學調查顯示全球3.5%～11.0%的兒童社區(qū)獲得性肺炎由HAdV感染引起[1]。迄今為止，HAdV有60余種血清型被發(fā)現(xiàn)，分為A～G 7個亞屬[2-4]，其中B亞屬中的HAdV-3和HAdV-7不僅流行范圍廣[1]，而且易引起兒童重癥肺炎，HAdV-7較HAdV-3可引起更嚴重的臨床表現(xiàn)，甚至導致死亡[5-8]。Wo等[5]報告104例HAdV-7感染患兒中53.9%診斷為重癥肺炎。中國臺灣學者報告，45例重癥HAdV肺炎中49%由HAdV-7感染引起，10例死亡的患兒中7例為HAdV-7感染[6]，早期快速精準診斷HAdV-7感染有重要意義。

病原菌宏基因組二代測序技術(mNGS)是一種新型的DNA/RNA檢測技術，測序速度快，靈敏度高，對于早期精準診斷感染性疾病病原體意義重大[9]。目前，關于mNGS檢測病毒感染的研究也相繼有報道，尤其在中樞神經系統(tǒng)感染中[10-11]，但國內關于該技術在HAdV檢測中的應用報道較少。本文回顧性分析了安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院(我院)兒科經mNGS技術確診的HAdV-7重癥肺炎患兒的臨床資料及mNGS結果，為臨床提供參考。

1 方法

1.1 診斷標準

1.1.1 HAdV-7重癥肺炎 符合《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)》[12]重癥肺炎的診斷標準，同時經肺泡灌洗液或血液病原菌mNGS鑒定為HAdV-7感染。

1.1.2 重癥肺炎并發(fā)心力衰竭及中毒性腦病 參照第8版《兒科學》[13]。

1.2 病例納入標準 2019年1月1日至11月30日在我院兒科住院、經mNGS確診重癥HAdV-7肺炎的患兒。

1.3 mNGS

1.3.1 標本收集及處理 取得家長對患兒行血液或肺泡灌洗液mNGS的知情同意后，抽取患兒外周靜脈血3 mL或收集肺泡灌洗液1.5 mL。血液標本：室溫儲存3～5 min后，8 h內4 000 rpm離心10 min。肺泡灌洗液標本：加入1 g直徑0.5 mm大小玻璃珠混合震蕩30 min。處理后標本置于-20℃凍存。

1.3.2 DNA提取 取0.3 mL處理后的血液或肺泡灌洗液，用TIANamp Micro DNA試劑盒(北京天根生物技術公司)提取DNA。

1.3.3 文庫構建和測序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫，插入片段200～300 bp，經環(huán)化形成單鏈環(huán)形結構。環(huán)化后的文庫經滾環(huán)復制(RCA)生成DNA納米球(DNB)。將制備好的DNB加載到測序芯片，使用BGISEQ-50進行測序(深圳華大基因股份有限公司)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析及檢測值意義 去除低質量和長度<35 bp的測序數(shù)據(jù)，通過BWA軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對，將高質量數(shù)據(jù)中的人類宿主序列的數(shù)據(jù)去除。進一步去除低復雜度序列后與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫比對，并將比對后的數(shù)據(jù)按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類和排列，報告致病菌的標準參考文獻[14]。該數(shù)據(jù)庫中包括序列已知的6 350種細菌(其中包括174種分枝桿菌和137種支原體/衣原體/立克次體)、1 798種DNA病毒、1 064種真菌和234種寄生蟲。

1.4 臨床資料截取 從病歷系統(tǒng)中截取患兒的臨床癥狀、體征、入院時和病情加重時(如出現(xiàn)低氧血癥或呼吸困難)的血常規(guī)和CRP等實驗室指標、胸部CT報告、治療和轉歸等。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以P50(P25，P75)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數(shù)資料以%表示，組間比較采用Fisher確切概率法；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 共20例患兒進入本文分析，男17例(85.0%)、女3例，年齡3個月至9歲，中位年齡1.2(0.9，3)歲，其中≤0.5歲1例(5.0%)，～2歲12例(60.0%)，>2歲7例(35.0%)。行血液和肺泡灌洗液mNGS各10例。1例9歲患兒系急性非淋巴細胞白血病移植術后，1例8歲患兒系急性髓系白血病移植術后，1例9月患兒系動脈導管未閉結扎術后，1例2歲半患兒系卵圓孔未閉，余16例患兒的病歷資料中未見基礎疾病。

2.2 臨床特征

2.2.1 癥狀和體征 均有發(fā)熱，體溫>39℃ 19例，總熱程>10 d 16例；均有咳嗽；喘息15例；呼吸困難10例。病程中肺部出現(xiàn)濕啰音17例，哮鳴音16例。肝臟增大9例，增大2～4(3.1±0.7)cm；脾臟增大1例，呈進行性，至肋下1～2 cm。肝、脾腫大均由于并發(fā)心力衰竭引起，其中1例系動脈導管未閉結扎術后，1例脾臟增大合并肝臟增大(患兒病情嚴重，最終死亡)。

2.2.2 實驗室檢查 入院時：WBC計數(shù)(×109·L-1)均值為8.6±4.3，其中>10者6例，<4者2例；中性粒細胞百分比(55.9±13.1)%；CPR(mg·L-1)中位數(shù)10.9(5.6，23.7)，>30者2例。

病情嚴重時[最早為入院2 d，最遲為入院14 d，平均(6.7±3.0)d]：WBC中位數(shù)8.3(3.1，17.6)，其中>10者8例，1例合并流感嗜血桿菌感染，2例合并支原體感染，5例僅HAdV-7感染；<4者6例，2例合并肺炎鏈球菌感染，1例合并結核桿菌+曲霉菌感染，2例合并支原體感染，1例僅HAdV-7感染。CRP中位數(shù)26.5(12.2，65.9)，>30者8例，其中合并肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、結核桿菌+曲霉菌、巨細胞病毒感染、支原體感染各1例，3例僅HAdV-7感染。中性粒細胞百分比(65.4±17.2)%，≤6歲患兒中>45%者15例，>6歲患兒中>55%者1例。淋巴細胞百分比(28.5±15.2)%。RBC(×1012·L-1)4.2±0.5，<4者6例。Hb(107.3±18.6)g·L-1。PLT(×109·L-1)242.1±99.5，<100者1例。白蛋白(g·L-1)35.8±5.8，<30者5例。ALT(U·L-1)中位數(shù)30.0(20.5，50.8)，>40者6例。AST(U·L-1)中位數(shù)82.0(57.3，107.8)，>40者16例。

2.2.3 影像學檢查 CT表現(xiàn)：兩肺受累17例，受累肺葉>3葉14例，向心性分布5例，肺實變17例，支氣管充氣征15例，斑片影14例，團簇狀影14例，充氣不均勻8例，磨玻璃影5例，小葉中心性結節(jié)9例，樹芽征6例，支氣管壁增厚9例，胸膜增厚7例，胸腔積液5例，氣胸1例，支氣管擴張1例。1例肺實變伴胸水患兒胸部CT影像學改變見圖1。

圖1 1例肺實變伴胸水患兒胸部CT

注 A：左肺下葉及右肺見點片狀密度增高影，伴支氣管充氣征(紅色箭頭所示)；B：左肺下葉及右肺可見點片狀實變影，右側胸腔可見弧形積液影(紅色箭頭所示)

2.2.4 并發(fā)癥 中毒性腦病1例，心力衰竭7例，心肌損害3例，腹瀉8例，肝功能損害6例，呼吸衰竭5例，胸腔積液5例，氣胸1例，急性呼吸窘迫綜合征1例，支氣管擴張1例，電解質紊亂5例。

2.2.5 治療及轉歸 20例患兒均予干擾素霧化吸入，每日2次，考慮合并有細菌感染時加用抗生素；19例應用IVIG治療，劑量1 g·kg-1·d-1，連用2 d；16例應用甲潑尼龍琥珀酸鈉1～2 mg·kg-1·d-1，連用5～7 d；7例使用呼吸機輔助通氣，其中2例氣管插管呼吸機輔助通氣，5例無創(chuàng)呼吸機輔助通氣，呼吸機輔助通氣時間中位數(shù)為9(3，10)d。

19例好轉出院，1例死亡，該患兒除HAdV-7感染外，同時合并肺炎鏈球菌感染，出現(xiàn)頑固性低氧血癥，予氣管插管呼吸機輔助通氣，病情好轉不明顯，PaO2/FiO2呈進行性下降，繼而出現(xiàn)多功能臟器衰竭，最終死亡。

2.3 血液或肺泡灌洗液mNGS結果 20例患兒入院至行mNGS檢測時間2～9(4.9±2.2)d，HAdV-7 DNA檢出序列數(shù)中位數(shù)為1 671.0(892.0，2 467.8)，覆蓋度37.6%～99.54%[98.9(89.8，99.1)%]。表1顯示，10例血液mNGS檢測HAdV-7 DNA檢出序列中位數(shù)為1 152.0(347.8，1 991.5)，覆蓋度為98.8(81.6，99.1)%；10例肺泡灌洗液mNGS檢出序列中位數(shù)和覆蓋度分別為2 033.5(1 263.2，2 901.8)和99.0(89.9，99.2)%。檢出單一HAdV-7 13例(65.0%)，HAdV-7+肺炎支原體4例(20.0%)，HAdV-7+流感嗜血桿菌、HAdV-7+流感嗜血桿菌+肺炎支原體、HAdV-7+煙曲霉菌+結核分枝桿菌復合群各1例(5.0%)。

表1 HAdV-7 mNGS結果

3 討論

文獻報道，HAdV感染發(fā)病高危年齡在2歲以下[7-8]。本組患兒6月齡至2歲者占60.0%，>2歲的7例中3例有基礎疾病，提示年長兒中免疫功能異常者對HAdV-7易感性較高，且可引起嚴重表現(xiàn)[15]。HAdV感染所致臨床表現(xiàn)與年齡、病毒血清型和宿主免疫功能有關。本組患兒表現(xiàn)為持續(xù)性高熱、咳嗽、喘息等，體檢肺部有濕啰音、哮鳴音，部分患兒有肝脾腫大，心力衰竭、呼吸衰竭和胸腔積液等并發(fā)癥，病情危重，與文獻[5～8]報道的HAdV-7感染表現(xiàn)相似。文獻報道，多數(shù)HAdV-7感染死亡病例與繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征相關[6-8]，本文1例患兒即死于急性呼吸窘迫綜合征。本文中累及中樞神經系統(tǒng)1例，低于文獻[7]報道的19.1%，可能與樣本數(shù)量較少有關。Kawasaki等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HAdV感染后，WBC計數(shù)和中性粒細胞百分比升高，且分類以中性粒細胞為主同時伴CRP升高。本組患兒WBC計數(shù)異常者占70%，其中40%升高，分類以中性粒細胞為主，CRP多升高；30%WBC計數(shù)降低，可能與HAdV-7感染后炎癥反應強烈，巨噬細胞大量激活，使骨髓造血處于抑制狀態(tài)有關[7, 17]。WBC計數(shù)異常的14例患兒中3例合并細菌感染，4例合并支原體感染，1例合并結核桿菌+曲霉菌感染，6例僅HAdV-7感染；CRP>30 mg·L-1的8例患兒中，2例合并細菌感染，1例合并結核桿菌+曲霉菌感染，1例合并巨細胞病毒感染，1例合并支原體感染，3例僅HAdV-7感染，提示上述表現(xiàn)還可能與后期混合感染有關。文獻報道，HAdV肺炎急性期病理改變?yōu)榫衷钚曰蛉诤闲詨乃佬苑谓櫤椭夤苎祝蚀笃瑢嵶?，炎癥區(qū)域的邊緣支氣管或肺泡上皮增生，影像學表現(xiàn)為大片的肺實變影伴支氣管充氣征[18-19]。本文患兒CT多表現(xiàn)為實變影伴支氣管充氣征，還有少量累及大小氣道改變，如充氣不均勻、小葉中心性結節(jié)、樹芽征、支氣管壁增厚等，與文獻報道相符。

重癥HAdV-7肺炎病情危重，因而早期快速檢測HAdV-7感染有重要意義。目前臨床HAdV診斷主要靠特異性核酸序列PCR和抗體檢測，陽性率不高，且常難以區(qū)分臨床亞型[20]。mNGS技術是新型的病原體檢測技術，無需培養(yǎng)，收集破壁后標本中的核酸片段，擴增后檢測其序列，再經生物信息學分析鑒定出其中所含病原體種屬，并可獲得序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)，敏感性高，檢測速度快，受病原菌數(shù)量影響較小，可廣泛用于細菌、真菌、病毒和支原體等的檢測[21-22]。本文20例患兒的血液或肺泡灌洗液標本經mNGS技術均鑒定出HAdV-7，DNA檢出序列中位數(shù)高，覆蓋度均值在90%以上，表明mNGS檢測HAdV-7有較好的可信度。HAdV一般經呼吸道感染人體后再入血引起全身癥狀，本研究中患兒住院至獲取標本時間血液短于支氣管肺泡灌洗液，故血中HAdV-7的DNA檢出序列中位數(shù)及覆蓋度均低于肺泡灌洗液中，即便如此，其檢出序列中位數(shù)仍可達1 152.0(347.8，199 1.5)，覆蓋度均值達98.8(81.6，99.1)%，提示mNGS對HAdV-7有較高的靈敏度。其原因可能與HAdV是一種無包膜的雙鏈DNA病毒有關[2-4]，無需破膜，也無需特殊的RNA收集管。

HAdV有較廣泛的組織易噬性，侵入機體后容易引起免疫功能變化，合并其他病原感染[2, 23]。國內的一項報道顯示，HAdV肺炎患者混合感染者高達81.9%，病原菌中以細菌多見，其中以革蘭陰性菌多見[23]。本文僅經mNGS檢測混合感染占35%，包括標本培養(yǎng)、PCR檢測、血支原體抗體等病原學檢測方法在內共檢出混合感染占65.0%，提示mNGS技術目前還無法完全替代臨床常用的檢測方法，但可作為病原體檢測的有效補充手段。混合感染中合并支原體最多見，可能與HAdV致使機體免疫功能紊亂以及兒童本身的易感性有關。有學者分析了上海一家醫(yī)院3年下呼吸道感染住院患兒中病原體流行病學特征，發(fā)現(xiàn)肺炎支原體檢出率最高，且混合感染中也以肺炎支原體合并其他感染最多見[24]。本文支原體檢出率較高可能也與本研究樣本量較小及mNGS未檢出其余病原體有關。另在1例移植術后患兒中檢出曲霉菌和結核感染。白血病患兒，尤其處于長期化療狀態(tài)時，一般PPD陽性率較低，GM實驗的敏感度也比較低[25]，故需要早期行mNGS，以制定精確的診治方案。

HAdV-7毒力強，目前尚缺少有效抗病毒藥物，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療、積極預防并發(fā)癥有重要意義。本文顯示，mNGS技術用于檢測HAdV-7有較好的可信度，對于混合感染也有一定的檢出率。故當<2歲嬰幼兒或有基礎疾病的年長兒出現(xiàn)持續(xù)性高熱，血常規(guī)WBC升高或降低，伴CPR高，胸部CT提示病變嚴重時，除細菌感染外，還需警惕HAdV-7感染，建議盡早完善mNGS檢查明確病因。