發(fā)酵乳中乳酸菌的分離鑒定及特性

付文雯，朱影，羅彤，邵翠翠，黃坤，劉艷，李詩瑤，馬弋

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，武漢430000）

0 引 言

乳酸菌是發(fā)酵葡萄糖，主要代謝終產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1]，其中大部分種類被認(rèn)為是安全的，可以參與體內(nèi)眾多的生理代謝活動，如緩解乳糖不耐癥、降低膽固醇、改善免疫功能、抗氧化以及抑制某些病原體的黏附[2-3]。除此之外，乳酸菌對重金屬，如鉛、鎘、銅等在具有良好的吸附能力[4]，可以減少重金屬在機(jī)體中的蓄積，減輕重金屬危害。

乳酸菌在自然界中種類繁多，分布廣，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上均分離出過乳酸菌，有些種類的乳酸菌甚至存在于人體的口腔、胃腸中[5-6]。因此，深入開展乳酸菌的研究，不僅在菌種獲取方面具有切實可行的現(xiàn)實條件，而且對保障食品安全、提高食品營養(yǎng)價值方面也具有重要的現(xiàn)實意義。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

M RS瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，青島海博；牛膽鹽，青島海博；氯化鈉，（分析純）；HCL，（分析純）；氫氧化鈉，（分析純）等。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計，日本日立；MALDI-TOF MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜，德國Bruker科技有限公司；p H計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司）；冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜，ICP-MS美國珀金埃爾默；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；高壓滅菌器，日本TOMY。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

稱取25 g樣品，置于225 mL生理鹽水中，均質(zhì)后，取一環(huán)在MRS平板上劃線，平板置36℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。觀察菌落形態(tài)，大小。

對不同形態(tài)的菌落，分別各挑取一環(huán)劃MRS平板進(jìn)行分離純化，再置36℃培養(yǎng)24～48 h，上基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）進(jìn)行鑒定。

1.3.2 MALDI-TOF MS對純化的微生物進(jìn)行鑒定

挑取單菌落，用無菌棉簽涂抹于MALDI靶點(diǎn)上 (每株菌涂抹5靶點(diǎn)) ，覆蓋1μL的HCCA基質(zhì)溶液，室溫干燥后，將靶板放入儀器進(jìn)行檢測。

1.3.3 乳酸菌耐膽鹽實驗

將目標(biāo)菌活化2代，37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，然后以2% 的接種量接入至含有質(zhì)量濃度為0.1g/100m L，0.2 g/100mL，0.5 g/100mL，0.7 g/100mL，1.0 g/100mL膽鹽的乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)，16 h取樣，用紫外分光光度計測定600 nm波長處的OD值。

1.3.4 乳酸菌的耐酸試驗

將目的菌株活化2代，37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，然后以2% 的接種量接入至p H值 為2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，6.8，7.0乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，在37℃溫度下靜置培養(yǎng)，用紫外分光光度計測定600 nm波長處的OD值。

1.3.5 氯化鈉耐受試驗

將目的菌株活化2代，37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，然后以2% 的接種量接入至分別含質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0% ，2% ，4% ，6% ，8% ，10% 氯化鈉的乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)，16 h取樣，用紫外分光光度計600 nm波長處的OD值。

1.3.6 乳酸菌鉛吸附實驗

在15 mL無菌離心管中加入質(zhì)量濃度100mg/L鉛離子水溶液1.0 mL，再分別加入不同體積菌懸液（質(zhì)量濃度50 g/L），使鉛離子水溶液中的菌體終質(zhì)量濃度分別達(dá)到0.5，1，1.5，2，2.5，5，10，25 g/L；最后用肉湯培養(yǎng)基定容至10 mL。恒溫培養(yǎng) (37℃) 60 min，取吸附液離心 (14 000 r/min,5 min) 獲得上清液，稀釋后使用ICP-MS測定其中鉛離子含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

從發(fā)酵乳中分離出2株革蘭氏陽性菌，分別命名為Z1，S1。兩株菌均為表面光滑、邊緣整齊、大小不一的圓形菌落，其中Z 1為乳白色，S1為白色略為透明。將兩株菌分別挑取單菌落純化后，利用M ALDI-TOF MS獲得兩株菌的特異性蛋白質(zhì)指紋圖譜，并對圖譜中蛋白質(zhì)標(biāo)識峰信息與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多重比較，其中Z 1為植物乳桿菌的鑒定分值為2.040，S1為鼠李糖乳桿菌的鑒定分值為2.097，均屬于比較可信的鑒定結(jié)果。兩株菌的質(zhì)譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 植物乳桿菌飛行時間質(zhì)譜圖

圖2 鼠李糖乳桿菌飛行時間質(zhì)譜圖

2.2 乳酸菌耐膽鹽實驗結(jié)果

將菌液接種在不同膽鹽濃度的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，以不含菌體、不含膽鹽的肉湯培養(yǎng)基為空白，在OD600nm下，測定吸光度。以膽鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，畫折線趨勢圖，如圖3所示。由圖3可以看出，兩株菌均隨著膽鹽濃度的升高呈下降的趨勢，但S1菌株的下降趨勢較Z1明顯。S1菌株在0～0.1g/100 mL階段下降趨勢最快，（0.1～0.2g）/100 mL 次之，0.2g/100 mL以后逐漸趨于平緩，說明S1菌株的生長對膽鹽非常的敏感。Z1菌株從整體上看下降的都比較平緩，在（0.2～0.5 g）/100 m L下降趨勢相對最大，隨后趨于平衡，說明0.5 g/100 mL膽鹽濃度可能是Z 1菌株的一個耐膽鹽的臨界點(diǎn)。從整體趨勢上來看，Z 1菌株較S1菌株耐膽鹽，Z 1菌株在膽鹽濃度為1.0 g/100 mL的肉湯培養(yǎng)基中，相對不含膽鹽的空白管，其OD值僅下降38% ，S1菌株在膽鹽質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL時，相對不含膽鹽的空白管其下降率就為63% ，在膽鹽質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL時，下降率就達(dá)93% ，基本快趨于不生長。

膽鹽耐受能力是益生菌的重要特性之一，有助于益生菌通過胃腸環(huán)境并在腸道定殖（正常情況下，人體腸道中的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.3% ～0.5%[7]），只有當(dāng)足夠數(shù)量的活菌成功在大腸定植，乳酸菌才能發(fā)揮其益生作用[8]。Z1菌株在膽鹽質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL條件下，也表現(xiàn)出良好的耐受性，對于后期將其作為添加劑應(yīng)用于產(chǎn)品空間很大。

圖3 兩株菌在不同膽鹽質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后的OD 600 nm值

2.3 乳酸菌耐酸實驗結(jié)果

將菌液接種在不同pH值肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后，以不含菌體的肉湯培養(yǎng)基為空白，在OD600nm下，測定吸光度。以p H值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，畫折線趨勢圖，如圖4所示。

圖4 兩株菌在不同pH值培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后的OD 600值

由圖4可以看出，隨著p H值的升高，兩株菌液的吸光度均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，均在6.8為最高點(diǎn)，其中S1隨著p H值的升高，上升的趨勢高于Z 1。在p H為4.5的肉湯培養(yǎng)基中，S1和Z1相對生長最旺盛p H值條件下菌體OD值，其相對生長率分別為52% 和62% ，表現(xiàn)出一定程度的耐酸性。

2.4 乳酸菌氯化鈉耐受試驗結(jié)果

將菌液接種在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，以不含菌體、不含氯化鈉的肉湯培養(yǎng)基為空白，在OD600nm下，測定吸光度。以氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，畫折線趨勢圖，如圖5所示。許多發(fā)酵食品的生產(chǎn)中會經(jīng)常使用NaCl作為主要配料，所以乳酸菌對NaCl的耐受能力會對其在含鹽發(fā)酵食品中的應(yīng)用造成影響[9]。從圖上我們可以看到S1菌株在氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0～2% 過程中，有一個迅速增長的過程，說明低鹽可以促進(jìn)S1菌株的生長，但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2% 后，又急速的下降，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于4% 后S1菌株就基本不生長了。Z 1菌株則表現(xiàn)出完全不一樣的特性，它在沒有氯化鈉存在的環(huán)境中生長的最好，隨著氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加生長逐漸受到抑制，在0～2% 階段下降速率最快，最后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于6% 后基本不生長了。

圖5 兩株菌在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后的OD 600值

2.5 乳酸菌鉛吸附實驗結(jié)果

因ICP-MS靈敏度高，檢出限低[10]，為防止樣品污染儀器，上機(jī)前將樣品稀釋1 000倍，并按照樣品中鉛溶液含量，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為5，10，20，40，50 μg/mL；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，相關(guān)系數(shù)為0.9992，現(xiàn)性良好。

圖6 鉛溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 兩株菌在不同菌體初始質(zhì)量濃度下對鉛吸附能力

兩株菌在不同初始菌體濃度條件下，對鉛吸附率結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，S1菌株的吸附能力整體高于Z1菌株。其中，S1菌株對鉛的吸附能力，隨著菌體濃度的增加吸附率呈現(xiàn)出先升高后下降的規(guī)律。菌體對鉛離子良好的耐受能力可能與其細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、吸附能力以及對鉛離子的外排能力有關(guān)[11]。當(dāng)菌體質(zhì)量濃度逐漸增加時，溶液中與鉛結(jié)合的活性位點(diǎn)也相應(yīng)增多，表現(xiàn)出吸附率升高，但是當(dāng)菌體質(zhì)量濃度大到一定程度，菌體之間相互吸附成團(tuán)，造成活性結(jié)合位點(diǎn)減少，反而使單位吸附量降低，吸附率下降[12]。而且細(xì)菌體內(nèi)重金屬含量高了之后，也會對其細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制其生長代謝，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，甚至致死，一定程度上也會影響微生物對重金屬的結(jié)合量和結(jié)合率。由圖7可以看出，在菌體質(zhì)量濃度為1.5 g/L時達(dá)到最大，然后開始逐漸下降，在質(zhì)量濃度為5 g/L時趨于穩(wěn)定。Z 1菌株的吸附率變化不是很規(guī)則，在質(zhì)量濃度為0.5 g/L和5 g/L時分別達(dá)到最大吸附量。

3 結(jié) 論

本研究從自然發(fā)酵的酸奶中分離出2株細(xì)菌，經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定為植物乳桿菌（Z1）和鼠李糖乳桿菌（S1），并對其部分生化特性做了分析。結(jié)果表明，S1菌株耐酸、嗜低鹽、不耐膽鹽，對鉛有一定吸附能力；Z1菌株耐酸、耐膽鹽、耐鹽，對鉛有一定的吸附作用。通過對兩株菌特性的了解，后期可以結(jié)合基因工程技術(shù)，對細(xì)菌DNA進(jìn)行人為干預(yù)，培育出具有特殊功能的乳酸菌，并將其廣泛應(yīng)用于環(huán)境中重金屬的處理，或者作為食品添加劑應(yīng)用于功能食品的開發(fā)，具有很強(qiáng)的社會效益。Zhai Qixiao等[13]將植物乳桿菌（L.plantarum）CCFM 8610用于去除水果汁和蔬菜汁中的鎘，2 h時的去除率為67% ～82% ，并利用此菌株開發(fā)出了一款酸豆乳產(chǎn)品，能有效緩解慢性鎘暴露對小鼠造成的毒性損傷[14]。不過將乳酸菌做成微生物制劑應(yīng)用到食品或者環(huán)境中還需進(jìn)一步探索，進(jìn)行更加全面和深入的研究。