植物乳桿菌發(fā)酵牛乳的研究進(jìn)展

江遠(yuǎn)智，石陽陽，嚴(yán)利文，李瑞，趙建新，陳衛(wèi)，張灝，杭鋒

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122；2.江南大學(xué)（揚州）食品生物技術(shù)研究所，江蘇揚州，225004）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，人們對于食品的要求也越來越高，不僅要求營養(yǎng)而且還需具備一定的功能。益生菌作為活的微生物，當(dāng)在人體腸道中達(dá)到一定數(shù)量，會對人體的健康有益[1]，可以調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，增強人體免疫力，治療胃腸道疾病等功能[2]，添加到食品中，可以在補充營養(yǎng)的過程中預(yù)防或治療各種疾病，即體現(xiàn)了食品的營養(yǎng)價值又賦予其特殊的功能。而且隨著益生菌研究領(lǐng)域的不斷深入，更多的益生菌被篩選出來，益生菌的理化特性和功能被研究的更為透徹，為益生菌在產(chǎn)品中的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。牛乳含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以為微生物提供豐富的碳源、氮源和生長因子，由于蛋白質(zhì)含量豐富，可以起到很好的緩沖作用[3]，為微生物生長提供了良好的環(huán)境，貯存期間還可以保持高的活菌數(shù)。以牛乳作為益生菌的載體[4]，基本可以滿足世界上絕大部分人對益生菌的需求[5]。乳酸菌是能將碳水化合物發(fā)酵成乳酸的低G+C革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱[6]，植物乳桿菌屬于乳酸菌屬，具有功能多和產(chǎn)酸能力強等特點，作為乳制品的功能菌株具良好的應(yīng)用前景。開發(fā)乳酸菌菌株作為酸奶功能菌株已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點，而國內(nèi)的研究起步比較晚，國內(nèi)酸奶發(fā)酵劑主要依靠國外進(jìn)口，因此，開發(fā)具有自我知識產(chǎn)權(quán)的具有發(fā)酵和益生功能的菌株非常重要。

1 植物乳桿菌研究進(jìn)展

1.1 植物乳桿菌的功能

植物乳桿菌具有較強的耐酸和耐膽鹽的能力[7-9]，較強的耐酸能力由于具有精氨酸脫亞胺酶（ADI）調(diào)節(jié)系統(tǒng)、蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）途徑[10]和堿性休克蛋白[11]，以及酸性條件下具有修復(fù)或保護(hù)受損的DNA和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制[12]；較強的耐膽鹽能力由于菌株胞外多糖、表面蛋白和應(yīng)激相關(guān)蛋白[11]，以及菌株對膽鹽的轉(zhuǎn)化能力[13]。

選擇益生菌的一項重要標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌粘附在人體胃腸道（GIT）上皮細(xì)胞的能力[14]，而益生菌在腸道中的粘附和隨后的定居是由位于細(xì)胞壁外表面的黏附素介導(dǎo)的，黏附素是蛋白質(zhì)，通過與GIT粘液層的相互作用或與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如纖維粘連蛋白、膠原和層粘連蛋白）的相互作用[15]。細(xì)菌黏附是一個復(fù)雜的過程，首先黏附素蛋白與受體之間發(fā)生非特異性物理相互作用，然后黏附素蛋白與其受體之間發(fā)生特定的相互作用。不能黏附在腸壁上的菌株，通過胃腸道到達(dá)小腸，其停留時間也只有數(shù)小時。植物乳桿菌對固定的膠原蛋白具有很強的黏附力[16]，Ashok等人[17]的研究表明，植物乳桿菌對ECM蛋白具有很高的結(jié)合能力。大部分植物乳桿菌與人體腸道細(xì)胞通過生化作用發(fā)生特異性粘附[17-18]，使植物乳桿菌粘附在人體腸道表面的能力強于致病菌，減少了致病菌的黏附，使致病菌不能在人體腸道中長時間停留，腸道中致病菌數(shù)量下降[19]，益生菌數(shù)量上升，因此，致病菌對人體的危害減輕，使人體患各種腸道疾病的風(fēng)險降低[20]，也使益生菌在腸道中停留時間延長，有助于益生菌發(fā)揮其功能。植物乳桿菌通過提高血清中的IgA、IgG、IgM水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，刺激活性氧、溶酶體酶和單核因子分泌，可以提高機(jī)體的免疫能力[21-22]。植物乳桿菌還具有減除有害因子的能力，如吸附重金屬鉛[23]、鎘[24]和鋁[25]，清除塑化劑[26]，清除全氟化合物，清除展青霉素[21,27]。通過將膽固醇插入、同化和黏附在益生菌細(xì)胞膜表面[28]，促進(jìn)膽固醇與膽汁反應(yīng)、轉(zhuǎn)運以及膽汁釋放過程[29]，使血漿中膽固醇水平降低[30]。植物乳桿菌還具有調(diào)節(jié)代謝、精神和神經(jīng)等功能。

1.2 植物乳桿菌應(yīng)用

至2018年10月，完成全基因組測序并提交至美國國立生物技術(shù)中心的植物乳桿菌菌株有67株，基因組草圖304株[21]。植物乳桿菌是公認(rèn)的具有益生功能的菌株[31]，具有高水平的表型和基因多樣性[32]，能夠占據(jù)各種生態(tài)位[33]，作為人體腸道常見共生菌。具有抑制腸道有害菌和致病菌的生長、降低膽固醇、清除有害因子、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)代謝紊亂、調(diào)節(jié)精神和神經(jīng)功能以及調(diào)節(jié)酒精性和非酒精性脂肪肝，而且具有較強的耐酸、耐膽鹽和耐滲透壓能力，從攝食到小腸發(fā)揮功能，能保持高的存活率。植物乳桿菌作為優(yōu)良的益生菌種，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品，作為乳制品、泡菜、肉類的發(fā)酵劑，還被添加到藥品、膳食補充劑、糖果零食、口腔護(hù)理、日化用品等產(chǎn)品中，發(fā)酵液或菌體作為畜禽飼料，增強畜禽的免疫力。作為擁有廣闊市場的乳制品，成為益生菌進(jìn)入人體的有效途徑。

2 植物乳桿菌發(fā)酵牛乳中氮源的吸收利用

2.1 酪蛋白的水解

乳酸菌的生長需要外界提供氨基酸和多肽，酪蛋白的水解產(chǎn)物可以為乳酸菌在牛乳中生長提供必須的營養(yǎng)物質(zhì)，以及產(chǎn)生多種生物活性肽，使發(fā)酵乳具有好的風(fēng)味和口感[34]。乳酸乳球菌水解酪蛋白如圖1[35]，酪蛋白被細(xì)胞壁蛋白酶水解為寡肽、三肽和二肽[35]，通過Opp、Dpp、Dtp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將多肽轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，在胞內(nèi)肽酶作用下，被水解為游離氨基酸。胞內(nèi)肽酶主要有x-脯氨酸二肽基氨基肽酶（PepX）、三肽酶（Pep T）、脯氨酸酶（PepQ）、脯氨酸亞胺肽酶（PepI）、二肽酶（PepD和PepV）、氨肽酶、羧肽酶和內(nèi)肽酶，負(fù)責(zé)將寡肽水解為游離的氨基酸。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Cod Y負(fù)性調(diào)節(jié)乳中蛋白水解酶系統(tǒng)的幾個組成部分的表達(dá)，抑制強度與異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸有關(guān)[35]，當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)豐富時，游離氨基酸和寡肽較多，蛋白水解酶系統(tǒng)被抑制。由于乳酸菌生長環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，可以從環(huán)境中攝取游離氨基酸及營養(yǎng)物質(zhì)，使糖代謝、攝取、發(fā)酵和氨基酸合成相關(guān)基因衰退[36-37]，導(dǎo)致大多數(shù)乳酸菌不能有效水解牛乳中的酪蛋白，以及缺乏肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，因此，部分乳酸菌在游離氨基酸和寡肽豐富的環(huán)境中生長旺盛，在牛乳中生長緩慢或不生長。

圖1 酪蛋白水解圖

2.2 肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

大部分乳酸菌為氨基酸營養(yǎng)缺陷型，牛乳中游離氨基酸含量低，需要從外界吸取自身生長繁殖所需的必須氨基酸，部分乳酸菌具有細(xì)胞壁蛋白酶，可以將乳蛋白水解為小分子肽，而肽酶位于細(xì)胞內(nèi)，乳蛋白的水解產(chǎn)物由Opp、Dpp、Dtp系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)被肽酶水解為菌株生長繁殖所需的氨基酸，Opp主要轉(zhuǎn)運寡肽，也可以轉(zhuǎn)運多肽，Dpp和Dtp主要轉(zhuǎn)運二肽和三肽，部分乳酸菌也具有Opt運載體[38]，可以協(xié)同Opp運載體共同完成多肽的轉(zhuǎn)運，在Opp缺乏的乳酸菌中Opt起主要運載作用。擁有Opp和Opt運載體的菌株能更好的吸收多肽，在與其它菌株的競爭占有更大的優(yōu)勢[39]。

Opp由OppA、OppB、OppC、OppD和OppF五個亞基組成，可以運輸4～35個氨基酸殘基，從5肽到9肽，肽與OppA的結(jié)合能力顯著升高，9肽的結(jié)合能力最強，5肽結(jié)合能力差，但不影響5肽的運輸[40]。受體和底物結(jié)合蛋白OppA通過N-末端脂質(zhì)錨錨定于膜上，具有開放和閉合構(gòu)象，不同的構(gòu)象對肽的親和力不一樣。OppA在開放的狀態(tài)下暴露出與溶液中特定氨基酸的作用位點，使多肽與Opp A結(jié)合，肽與受體蛋白通過氫鍵和靜電相互作用力結(jié)合，Detmers[40]通過將緩激肽1～9位點的的氨基酸用其它氨基酸替代，當(dāng)4、5和6位點的氨基酸被替代，緩激肽與OppA的結(jié)合能力顯著降低，說明肽鏈中4、5和6位點的氨基酸的親和力強于其它位點的氨基酸，其N和C末端與Opp A的結(jié)合更具有彈性，與多肽的序列無關(guān)[41]。疏水氨基酸更利于結(jié)合，而甘氨酸、脯氨酸和負(fù)電荷殘基降低了結(jié)合親和力。Helinck[42]通過固相萃取將酪蛋白衍生肽分離為酸性、堿性和中性部分，酸性和堿性肽存在可以降低YGGFL轉(zhuǎn)運率，而中性肽對YGGFL轉(zhuǎn)運沒有影響，因此，酪蛋白衍生肽中只有陽離子和陰離子起競爭作用，可以抑制目標(biāo)肽的轉(zhuǎn)運。兩個同源整合膜蛋白Opp B和Opp C，它們一起形成易位孔，兩個同源核苷酸結(jié)合域Opp D和Opp F，通過ATP結(jié)合和水解促進(jìn)肽轉(zhuǎn)運。

肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)成為乳酸菌在牛乳中增殖的瓶頸，存在細(xì)胞壁蛋白酶的乳酸菌同樣需要肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，在游離氨基酸和寡肽豐富的環(huán)境中，乳酸菌可以通過Opp、Dpp、Dtp將肽轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，而在游離氨基酸和寡肽含量較低的環(huán)境中，肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和蛋白水解酶成為乳酸菌在其中生長不可或缺的兩個組成部分，蛋白水解酶將大分子蛋白質(zhì)水解為寡肽和游離的氨基酸，肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)供細(xì)菌生長繁殖。

2.3 氨基酸缺陷對植物乳桿菌在牛乳中生長和增殖的影響

對于乳酸菌而言，牛乳中的碳源和氮源的比例影響其代謝產(chǎn)物，當(dāng)?shù)床蛔銜r，氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成受到影響，牛乳中的活菌數(shù)難以提高，人飲用后難以起到益生作用，限制了該菌株在牛乳中的使用，當(dāng)碳源不足時，會影響胞內(nèi)的糖和脂類代謝過程，影響細(xì)胞的產(chǎn)能和產(chǎn)酸。

基因組測序和比較基因組雜交揭示了植物乳桿菌基因組的高度多樣性和靈活性以及代謝的多樣性[43]，具有磷酸轉(zhuǎn)移酶（PTS）和糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)酶類的相關(guān)基因[11]，包含EMP途徑和磷酸乙酮醇酶的編碼基因[44]，糖利用的基因盒如圖2[43]，其中含有25個完整的（PTS）糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和完善的丙酮酸鹽代謝系統(tǒng)，能將胞外單糖和寡糖轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，適合在含各種糖源的環(huán)境中生長，在良好的生長環(huán)境中，植物乳桿菌代謝產(chǎn)酸能力強。

植物乳桿菌基因通常以大簇和操縱子形式存在，自身可以合成除纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸外的全部氨基酸[44]，因此，植物乳桿菌不能在缺乏纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸基質(zhì)中生長。牛乳中寡肽和游離的氨基酸含量低[45]，而且植物乳桿菌缺乏PrtP基因[44]，不能合成細(xì)胞壁蛋白酶，使酪蛋白水解的第一步很難完成，由于沒有專門運載酪蛋白的運載體，氨基酸不能通過水解酪蛋白和多肽得到及時的補充，氨基酸必須以其它代謝的中間代謝產(chǎn)物為原料合成，降低了氨基酸的產(chǎn)生速率，導(dǎo)致胞內(nèi)一些重要酶的合成受到影響，影響了胞內(nèi)DNA、RNA、脂質(zhì)和糖的合成，導(dǎo)致植物乳桿菌在牛乳中生長緩慢。

圖2 糖利用基因盒

3 促進(jìn)植物乳桿菌在牛乳中增殖方法

大多數(shù)乳酸菌蛋白水解能力弱，對營養(yǎng)要求苛刻，需要在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中生長，在牛乳中生長緩慢，需要補充乳酸菌可以利用的有機(jī)氮源[46]。植物乳桿菌缺乏細(xì)胞壁蛋白酶[47]，乳蛋白在胞外不易被水解[48]，可以直接被植物乳桿菌生長繁殖利用的乳蛋白的水解產(chǎn)物少，導(dǎo)致植物乳桿菌生長繁殖的底物需要重新合成或必須氨基酸缺失，植物乳桿菌在牛乳中生長緩慢或不生長。植物乳桿菌胞內(nèi)含有多種肽酶，可以水解胞內(nèi)的寡肽為其生長代謝提供必須的氨基酸，可以通過添加各種含寡肽的食品級配料，通過寡肽轉(zhuǎn)運蛋白Opp、Dpp、Dtp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將寡肽和氨基酸運輸?shù)桨麅?nèi)，寡肽在胞內(nèi)肽酶作用下被水解，補充生長所需的必須氨基酸，使植物乳桿菌可以在牛乳中增殖。實驗室和工業(yè)生產(chǎn)通過添加增殖劑和協(xié)同發(fā)酵改善植物乳桿菌在牛乳中的生長情況。

3.1 添加增殖劑

國內(nèi)外研究做了在牛乳中添加氨基酸、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、果蔬汁和酪蛋白水解產(chǎn)物等增殖劑，使植物乳桿菌在牛乳中增殖。Ma等人實驗證明異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和核苷酸前體物質(zhì)為植物乳桿菌在牛乳中增殖的必須成分[49]，其中一種氨基酸的缺乏會影響植物乳桿菌在牛乳中的生長速率和活菌總數(shù)。Yang等[50]人研究表明，添加10% 的黑莓汁可以使植物乳桿菌在中牛乳中活菌數(shù)達(dá)到1×1010cfu/g，黑莓汁的添加還可以抑制致病菌的生長。Gilles[46]在牛乳中添加酪蛋白的水解產(chǎn)物促進(jìn)植物乳桿菌增殖，可以使活菌數(shù)達(dá)到1×109cfu/g，添加量為1% 時，既可以起到好的促進(jìn)作用，隨著添加量的增加，活菌數(shù)并沒有呈線性增加，可見酪蛋白水解產(chǎn)物中含有植物乳桿菌在牛乳中生長的限制因子。Saguir[51]實驗表明二肽比游離的氨基酸更適合作為植物乳桿菌生長繁殖的氮源，二肽和游離氨基酸都可以促進(jìn)植物乳桿菌的增殖，但添加二肽的促進(jìn)效果比添加游離氨基酸好，并且活菌數(shù)高。國內(nèi)研究做了在牛乳中添加酵母提取物、酪蛋白酶解物、蛋白胨等作為增殖劑，可以使植物乳桿菌在牛乳中活菌數(shù)達(dá)到1×109cfu/g[52]。通過添加增殖劑，可以使植物乳桿菌在牛乳中達(dá)到較高的活菌數(shù)，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中可以添加促進(jìn)植物乳桿菌在牛乳中增殖的食品級配料，即可以豐富酸奶的種類，也可促進(jìn)植物乳桿菌的生長。

3.2 協(xié)同發(fā)酵

植物乳桿菌水解酪蛋白的能力較弱，瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌等其它乳酸菌具有酪蛋白水解能力，可以借助水解酪蛋白能力強的乳酸菌水解酪蛋白作為植物乳桿菌的底物，促進(jìn)植物乳桿菌在牛乳中生長。Gilles[46]實驗表明，酪蛋白水解產(chǎn)物可以被植物乳桿菌利用，可以選擇合適的乳酸菌與植物乳桿菌共同作為牛乳的發(fā)酵菌株，促進(jìn)植物乳桿菌在牛乳中生長。協(xié)同發(fā)酵過程中菌株可以相互交換代謝物和信號分子提高菌株在環(huán)境中的適應(yīng)能力[53]，產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)。兩株或多株菌作為牛乳的發(fā)酵菌株可以產(chǎn)生更多的芳香型化合物[53]，還可以增加酸奶的益生功能。Cemile[54]研究表明，S.thermophilus RSKK 04082、L.delbrueckii subsp.bulgaricus DSM 20081和L.plantarum RSKK 02030單獨作為牛乳的發(fā)酵菌株，產(chǎn)酸能力都不強，相同培養(yǎng)條件下，協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酸更快和總活菌數(shù)更高。植物乳桿菌單獨在牛乳中生長的能力差，在儲藏期間活菌數(shù)保持極佳的穩(wěn)定性，Sarn[55]研究證明植物乳桿菌可以在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵牛乳中生長，預(yù)培養(yǎng)的植物乳桿菌（4.5% NaCl，p H 4.5或6.5）會顯著降低發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌活菌數(shù)，緩解了發(fā)酵乳的后酸化，而總活菌數(shù)也保持在較高水平。與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵，可以增加酸奶在儲藏期間的穩(wěn)定性使新鮮生產(chǎn)的酸奶中自發(fā)脫水作用相對降低，在冷藏階段后期，酸奶樣品中的蛋白水解相對增加[56]。

4 結(jié)束語

通過對植物乳桿菌基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，完成了部分菌株的全基因組測序和蛋白質(zhì)組圖，可以從基因和蛋白質(zhì)層面更深入了解植物乳桿菌代謝機(jī)制，更加清晰的闡明植物乳桿菌的理化特征和生理功能。植物乳桿菌具有較強的耐酸、耐膽鹽和耐滲透壓的能力，可以提高菌株在胃腸道中的存活率，具有很好的益生特性。植物乳桿菌由于缺乏PrtP基因，不能合成細(xì)胞壁蛋白酶，不能水解牛乳中的乳蛋白，胞內(nèi)多肽和氨基酸等氮源得不到及時的補充，只能由自身合成，影響了DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致植物乳桿菌在牛乳中生長緩慢或不生長，限制了其在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用，近來的研究，通過在牛乳中添加寡肽含量豐富的食品及配料和協(xié)同發(fā)酵等方法可以使植物乳桿菌在牛乳中增殖，說明植物乳桿菌擁有肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，在肽和氨基酸含量豐富的環(huán)境中可以很好的生長，同時，以牛乳作為植物乳桿菌的傳遞途徑，將會使植物乳桿菌擁有廣闊的市場，基于植物乳桿菌的益生功能，將來還會開發(fā)新的增殖劑和協(xié)同發(fā)酵菌株，也可以豐富酸奶的種類。