PMA-LAMP法可視化檢測(cè)乳中沙門(mén)氏菌

王冠蕾

（承德石油高等專(zhuān)科學(xué)校，河北承德067000）

0 引言

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是世界上最常見(jiàn)的食源性致病微生物之一，能夠引起人類(lèi)和許多其他動(dòng)物疾病，如人腸胃炎、傷寒病、敗血癥等[1]。隸屬于腸桿菌科，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，兼性厭氧，革蘭氏呈陰性。沙門(mén)氏菌菌屬類(lèi)型多樣，抗原復(fù)雜，基于O抗原和H抗原，目前已分離出2 500多個(gè)血清型，且生物體高度多樣化，并仍在演變。作為一種最常見(jiàn)的細(xì)菌性病原體，可以通過(guò)棲息環(huán)境、飼養(yǎng)過(guò)程以及水源傳播，并通過(guò)原料乳、肉類(lèi)或蛋類(lèi)等動(dòng)物源性食物的不恰當(dāng)烹飪或加工過(guò)程而傳染人類(lèi)[2-4]。研究報(bào)道，嬰兒配方奶粉（Powdered infant formula，PIF）是沙門(mén)氏菌感染嬰兒的主要途徑[5]。因此，沙門(mén)氏菌的污染及其在PIF中快速檢測(cè)方法是關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。

目前分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中，成為了一種新型的快速鑒定方法并具有一定的優(yōu)勢(shì)。其中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于其簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)線低等特點(diǎn)，應(yīng)用范圍逐漸拓寬，具有較大的發(fā)展前景[6-8]。LAMP技術(shù)的研發(fā)是由日本Notomi博士利用體外擴(kuò)增核酸的原理[9]，設(shè)計(jì)4～6條LAMP引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，一定的恒溫條件可引發(fā)自動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，對(duì)DNA進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到快速擴(kuò)增目標(biāo)核酸片段的目的，其已經(jīng)被用于食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)[10-12]。對(duì)于產(chǎn)物的檢測(cè)，可利用羥基萘酚藍(lán)（hydroxy naphthol blue，HNB）染料預(yù)先添加到反應(yīng)體系中進(jìn)行可視化檢測(cè)，HNB根據(jù)溶液反應(yīng)前后p H值的不同而產(chǎn)生顏色變化，陽(yáng)性結(jié)果為天藍(lán)色，陰性結(jié)果為紫羅蘭色，從而用肉眼即可對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察判斷。整個(gè)過(guò)程避免了開(kāi)蓋檢測(cè)，因此不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，也不需要專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)設(shè)備，經(jīng)濟(jì)實(shí)用并適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，與LAMP技術(shù)的結(jié)合在近年內(nèi)被廣泛關(guān)注和應(yīng)用[13-16]。但由于LAMP方法的高檢測(cè)靈敏度，能同時(shí)擴(kuò)增樣品中的死菌和活菌的DNA，易造成高估樣品中活菌的水平和假陽(yáng)性結(jié)果。美國(guó)Biotium公司研發(fā)的熒光染料—疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）具有幾乎完全細(xì)胞膜不滲透性，可以選擇性的結(jié)合從死細(xì)胞中暴露出來(lái)的DNA，而遠(yuǎn)離未受損傷的活細(xì)胞中完整的DNA，從而有效地用于死/活菌的區(qū)分[17-19]。

本研究建立一種以熒光染料PMA與LAMP快速檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法，以沙門(mén)氏菌siiA基因?yàn)樘禺愋园袠?biāo)，同時(shí)結(jié)合HNB可視化檢測(cè)方法，用于快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)PIF中沙門(mén)氏菌，為食品中致病菌的檢測(cè)開(kāi)辟一個(gè)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用菌株見(jiàn)表1。使用的主要試劑有：引物，北京諾賽基因組研究中心有限公司；PMA，美國(guó)Biotium公司；LB培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司；2×Taq PCR MasterMixTaq，北京天根生物技術(shù)有限公司；Bst2.0 DNA Polymerase，New England Biolabs公司；MgSO4，New England Biolabs公司；d NTPs，北京天根生物技術(shù)有限公司；羥基萘酚藍(lán)（HNB），美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

表1 試驗(yàn)用菌株及其來(lái)源和LAMP檢測(cè)結(jié)果

1.2 儀器與設(shè)備

移液器，Eppondorf公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYY-10C型電泳儀，上海安亭科學(xué)儀器廠；UVP凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；ZHWY200B型恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；精密電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.4 HNB染料的優(yōu)化及可視化檢測(cè)體系的建立

1.2.4 裸鼠移植瘤模型構(gòu)建 取對(duì)照組、陰性組、干擾組CaSki細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液將細(xì)胞消化，1000 g離心10 min，把上清溶液吸棄，添加PBS，將細(xì)胞配制成每毫升含有4×107細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，吸取300 μL注射至裸鼠右側(cè)后腿皮下，裸鼠均出現(xiàn)移植瘤。分別在接種CaSki細(xì)胞后7、12、17、22、27 d測(cè)量腫瘤體積，腫瘤體積=（長(zhǎng)徑×短徑2）÷2。在最后1次測(cè)量腫瘤體積后，脫臼法將裸鼠處死，取腫瘤組織，稱(chēng)取腫瘤質(zhì)量。

九條“高壓線”遲恒條條碰，說(shuō)是碰，又像是在上面走鋼絲，平衡功夫似乎不錯(cuò)，因?yàn)槠駷橹梗凰钡降哪切┎块T(mén)，只有來(lái)求情的，沒(méi)有來(lái)問(wèn)罪的，至少說(shuō)明一點(diǎn)，也是很重要的一點(diǎn)，此人穩(wěn)重。

1.3.2 DNA的提取

在花生的生長(zhǎng)過(guò)程中，如何更好的發(fā)揮出單粒精播的優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)農(nóng)戶(hù)和科研人員都在思考的一個(gè)問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)花生種植過(guò)程中種子處理、整地翻地、田間管理等方面進(jìn)行分析，希望可以為農(nóng)戶(hù)以及研究人員提供一些參考。

4.4.2 搭建網(wǎng)絡(luò)交流平臺(tái)。利用網(wǎng)絡(luò)虛擬平臺(tái)，進(jìn)行教師實(shí)踐指導(dǎo)、學(xué)生分組討論和實(shí)踐成果分享，引領(lǐng)學(xué)生在理解與合作的情感狀態(tài)下開(kāi)展綜合實(shí)踐活動(dòng)；拍攝環(huán)境生態(tài)工程綜合實(shí)習(xí)視頻，整合理論教學(xué)過(guò)程中已有的專(zhuān)題實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容資源(圖片、視頻、網(wǎng)頁(yè)等)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分享；通過(guò)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行教師與學(xué)生、學(xué)生與學(xué)生之間的實(shí)踐互動(dòng)(如經(jīng)驗(yàn)分享、個(gè)案解析、成果展示等)。

1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與LAMP擴(kuò)增

隨著互聯(lián)網(wǎng)與移動(dòng)終端的緊密結(jié)合，從電子商務(wù)到互聯(lián)網(wǎng)金融，每時(shí)每刻都在產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)分析方式已不能適合金融機(jī)構(gòu)的業(yè)務(wù)，數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)多維度、大數(shù)據(jù)的智能、批量處理，更貼合信息化時(shí)代的風(fēng)控要求。金融投資行業(yè)越來(lái)越多地采用機(jī)器學(xué)習(xí)、數(shù)據(jù)挖掘的方法進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。大數(shù)據(jù)已經(jīng)成為金融機(jī)構(gòu)加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)控制的重要手段。然而，實(shí)際采集得到的數(shù)據(jù)中，各種類(lèi)數(shù)據(jù)樣本的分布并不均勻，使得某些類(lèi)型的數(shù)據(jù)被淹沒(méi)在巨量數(shù)據(jù)中，影響數(shù)據(jù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此如何充分利用采集得到的數(shù)據(jù)，對(duì)于準(zhǔn)確有效的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)分析，顯得尤為重要。

本研究針對(duì)沙門(mén)氏菌保守序列siiA基因（STM 4257，在NCBI中的序列號(hào)為：NC_003197）[20]，利用在線軟件PrimerExplorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html），設(shè)計(jì)4條LAMP引物，包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP。引物序列見(jiàn)表2。

采用25μL LAMP擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)，分別對(duì)引物比例、試劑濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并利用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，選擇最優(yōu)條件對(duì)提取的DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

1.3.1 菌株的培養(yǎng)與保藏

用去離子水將HNB粉末稀釋為1.5 mmol/L濃度的母液并進(jìn)行分裝，于-20℃下避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?。之后?yōu)化LAMP體系中HNB染料的濃度，調(diào)整其母液的添加量使體系中終濃度分別為90、120、150、180、210 μmol/L，并進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，以2μL雙蒸水代替DNA作為陰性對(duì)照。根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果顯示天藍(lán)色，陰性結(jié)果顯示紫色的情況選擇HNB的最佳濃度。從而建立針對(duì)沙門(mén)氏菌的LAMP-HNB可視化檢測(cè)體系。

1.3.5 菌液的PMA處理

在20 mL LB液體培養(yǎng)基中，以2% 的接種量加入凍存菌液，于37℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)8 h，并重復(fù)一次對(duì)菌液進(jìn)行二次活化。之后經(jīng)LA固體培養(yǎng)基活化后，挑取單菌落在相同條件下培養(yǎng)8 h，以獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的菌種，用于后續(xù)試驗(yàn)。取上述菌液750μL加入凍存管，再加入250μL 80% 甘油，無(wú)菌條件下將液體混勻并密封，置于-20℃冰箱中保藏。

據(jù)葉靄玲說(shuō)，當(dāng)白麗筠去拉房地產(chǎn)大鱷森達(dá)房地產(chǎn)公司李老板的存款時(shí)，被李老板招了安，成為身家上億的李老板的小三，順便在李老板的公司當(dāng)了售樓小姐。這里的主次關(guān)系是與白麗筠的講述顛倒的。我不知道究竟該相信哪一個(gè)版本，但是所謂兼聽(tīng)則明，兩方面都聽(tīng)到，事實(shí)真相基本上就清楚了。

PMA溶解于二甲亞砜（DMSO）中，配制成1 mg/mL的PMA溶液，-20℃黑暗處保存。取1 mL制備好的菌懸液置于2 mL離心管中，加入PMA溶液至終濃度為3μg/mL，混勻后在室溫條件下避光培養(yǎng)5 min，然后放置在距離光源20 cm處，利用650W鹵素?zé)羝毓? min，為了防止溫度過(guò)高應(yīng)將樣品放在冰上進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)后的懸浮液于13 000×g離心5 min，得到的沉淀用于后續(xù)試驗(yàn)。本研究采用95℃熱處理3 min殺死菌體，然后分別取1 mL活菌液和死菌液，經(jīng)PMA處理后用于DNA提取和LAMP檢測(cè)，同時(shí)分別取1 mL未經(jīng)PMA處理的活菌液和死菌液作為對(duì)照。

表2 LAMP引物及序列

1.3.6 特異性驗(yàn)證

1.3.7 純培養(yǎng)物靈敏度檢測(cè)

應(yīng)用構(gòu)建好的PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)方法，針對(duì)14株沙門(mén)氏菌和9株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶的有無(wú)和添加HNB的體系顏色變化，判斷檢測(cè)方法的特異性。每個(gè)菌株均做三組平行試驗(yàn)。

選取鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028作為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并用0.85% 的生理鹽水將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋并涂布計(jì)數(shù)，確定其活菌濃度，使目標(biāo)菌濃度范圍在107～10-1CFU/mL之間，之后加入固定濃度的死菌，經(jīng)PMA處理后提取不同濃度菌液的DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，利用LAMP-AGE和LAMP-HNB法分別對(duì)2μL產(chǎn)物進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。

本研究利用一步法快速提取細(xì)菌基因組DNA。取300μL細(xì)菌培養(yǎng)液于2 mL EP管中，12 000×g離心2 min，棄去上清液，向沉淀中加入300μL DNA提取液（25% Chelex-100，p H=8.0），混勻后于95℃下水浴10 min，再冰浴3 min，然后12 000×g離心2 min，取上清液（即為DNA）并于-20℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.8 嬰兒配方奶粉靈敏度檢測(cè)

將購(gòu)買(mǎi)的嬰兒配方奶粉按照FDA建議的常規(guī)檢驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè)，以確定奶粉中完全不含有沙門(mén)氏菌[21]。然后取10 g奶粉溶于90 mL無(wú)菌的蛋白胨水溶液中，均勻混合，分別加入不同稀釋度的純培養(yǎng)菌液，以獲得沙門(mén)氏菌的終濃度范圍在107～10-1CFU/g之間的人工污染PIF樣品。經(jīng)PMA處理后，提取奶樣中沙門(mén)氏菌的基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并利用LAMP-AGE和LAMP-HNB法分別對(duì)2μL產(chǎn)物進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，以確定檢出限。同時(shí)，與傳統(tǒng)PCR方法作比較。

醫(yī)療損害糾紛案件中由于專(zhuān)業(yè)所限，常需要對(duì)患者的損傷程度、診療行為與損害結(jié)果是否存在因果關(guān)系等專(zhuān)門(mén)性問(wèn)題進(jìn)行鑒定，以使法官更深入地了解案情，便于做出公正的裁判。侵害患者知情同意權(quán)責(zé)任糾紛案件亦有許多需要進(jìn)行鑒定之處，但部分判決書(shū)對(duì)于鑒定部分的闡述過(guò)于簡(jiǎn)單，使人難以清楚了解鑒定的事項(xiàng)。在這些判決書(shū)中，對(duì)于鑒定意見(jiàn)進(jìn)行總結(jié)書(shū)寫(xiě)僅僅一句帶過(guò)，使閱讀者僅能知悉醫(yī)院是否有過(guò)錯(cuò)，承擔(dān)責(zé)任的輕重，難以進(jìn)一步了解其他信息，比如有判決書(shū)的表述為：“結(jié)論為該爭(zhēng)議屬于一級(jí)甲等醫(yī)療事故，醫(yī)院承擔(dān)輕微責(zé)任?！盵12]未明確說(shuō)明為何認(rèn)定醫(yī)院承擔(dān)輕微責(zé)任以及醫(yī)院應(yīng)承擔(dān)責(zé)任的具體比例，僅以“輕微”二字概括，過(guò)于簡(jiǎn)略。

10月22日，中國(guó)工會(huì)十七大在北京勝利召開(kāi)。大會(huì)主題：以習(xí)近平新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義思想為指導(dǎo)，堅(jiān)持走中國(guó)特色社會(huì)主義工會(huì)發(fā)展道路，忠誠(chéng)黨的事業(yè)，竭誠(chéng)服務(wù)職工，團(tuán)結(jié)動(dòng)員億萬(wàn)職工為決勝全面建成小康社會(huì)、奪取新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義偉大勝利而奮斗！向全會(huì)上下發(fā)出號(hào)令，提出要求。此時(shí)此刻，重溫、學(xué)習(xí)、領(lǐng)會(huì)、踐行習(xí)近平關(guān)于工人階級(jí)和工會(huì)工作的重要論述，對(duì)于把建設(shè)有中國(guó)特色社會(huì)主義工會(huì)偉大事業(yè)不斷推向前進(jìn)，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的歷史意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP體系的確定

通過(guò)對(duì)LAMP體系中各組分及反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了最佳的LAMP反應(yīng)條件：采用25μL體系，含有0.2μmol/L外引物F3/B3、1.6μM內(nèi)引物FIP/BIP、1.8 mmol/L d NTPs、2.5μL 10×ThermoPol Buffer、4 mmol/L MgSO4、0.9μL Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase（8 u/μL）和2μL模板DNA，加入雙蒸水至25μL。將體系置于65℃反應(yīng)45 min，80℃條件下2 min終止反應(yīng)。

2.2 羥基萘酚藍(lán)染料添加量的確定

LAMP體系的HNB優(yōu)化結(jié)果如圖1所示。陰性對(duì)照組呈紫色，當(dāng)HNB的濃度為90μmol/L和120 μmol/L時(shí)，陽(yáng)性反應(yīng)體系未變色，仍顯示紫色，當(dāng)HNB的濃度不低于150μmol/L時(shí)，陽(yáng)性反應(yīng)體系呈現(xiàn)天藍(lán)色，因此HNB染料的最佳終濃度為150μmol/L，可實(shí)現(xiàn)LAMP-HNB可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌。

2.3 PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)方法的建立

圖1 HNB濃度的優(yōu)化

PMA作為一種分子染料，只能穿過(guò)已死亡細(xì)菌的細(xì)胞膜（壁），在光激發(fā)后能與DNA共價(jià)結(jié)合，從而阻斷其擴(kuò)增反應(yīng)。為了證明PMA-LAMP可視化方法能夠選擇性只擴(kuò)增活菌從而進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。泳道2至泳道4均有LAMP擴(kuò)增條帶，而泳道5未出現(xiàn)LAMP擴(kuò)增結(jié)果。說(shuō)明PMA-LAMP方法能夠有效地抑制死菌的擴(kuò)增，使其只檢測(cè)活菌，防止假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。同時(shí)LAMP-HNB檢測(cè)結(jié)果與電泳結(jié)果一致，說(shuō)明利用HNB染料進(jìn)行可視化檢測(cè)的可行性。因此，PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法成功建立。

圖2 PMA-LAMP-HNB方法的建立

2.4 可視化檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證

針對(duì)全部34株菌株，經(jīng)PMA處理后，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的兩種檢測(cè)方法結(jié)果如表1所示，對(duì)所有14株沙門(mén)氏菌的AGE和HNB可視化檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)所有的20株非沙門(mén)氏菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。因此證明PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)方法對(duì)沙門(mén)氏菌具有特異性。

2.5 純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度

沙門(mén)氏菌純培養(yǎng)物靈敏度的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，通過(guò)平板計(jì)數(shù)以確定沙門(mén)氏菌的濃度范圍為4.6×107CFU/mL至4.6×10-1CFU/mL。對(duì) 于PMA-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，AGE和HNB染料法的結(jié)果表現(xiàn)一致。在對(duì)照組顯示陰性的情況下，當(dāng)純培養(yǎng)物活菌的濃度在4.6×107CFU/mL至4.6×101CFU/mL時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而在100CFU/mL和10-1CFU/mL濃度時(shí)均呈現(xiàn)陰性。因此PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)方法對(duì)于沙門(mén)氏菌活菌的檢測(cè)靈敏度為4.6×101CFU/mL，與AGE檢測(cè)靈敏度相同。

圖3 沙門(mén)氏菌純培養(yǎng)物的靈敏度

2.6 人工污染乳中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度

PIF中沙門(mén)氏菌靈敏度的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，通過(guò)平板計(jì)數(shù)以確定人工污染乳中沙門(mén)氏菌活菌的濃度范圍為6.3×107CFU/g至6.3×10-1CFU/g。當(dāng)目標(biāo)菌濃度在6.3×107CFU/g至6.3×101CFU/g時(shí)，電泳結(jié)果出現(xiàn)LAMP擴(kuò)增典型的T型條帶，帶HNB染料的體系均呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的天藍(lán)色，此時(shí)對(duì)照組呈現(xiàn)陰性結(jié)果，說(shuō)明LAMP-HNB檢測(cè)法靈敏度為6.3×101CFU/g，而PCR-AGE法的靈敏度為6.3×103CFU/g。因此，PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)方法對(duì)于PIF中沙門(mén)氏菌活菌的檢測(cè)靈敏度與AGE檢測(cè)靈敏度相同，是傳統(tǒng)PCR方法的100倍。

圖4 嬰兒配方奶粉中沙門(mén)氏菌的靈敏度

3 結(jié)論

本研究基于沙門(mén)氏菌siiA基因設(shè)計(jì)4條LAMP引物，在65℃恒溫條件下擴(kuò)增45 min，通過(guò)預(yù)先向體系中添加150μmol/L HNB染料，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化檢測(cè)。同時(shí)利用3μg/mL PMA熒光染料對(duì)菌液進(jìn)行預(yù)處理，防止假陽(yáng)性結(jié)果，達(dá)到檢測(cè)活菌的目的，從而建立一種針對(duì)嬰兒配方奶粉中沙門(mén)氏菌的PMA-LAMP-HNB可視化檢測(cè)方法?？倷z測(cè)時(shí)間不超過(guò)1 h 30 min，對(duì)純培養(yǎng)物和人工污染PIF中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度分別為4.6×101CFU/mL和6.3×101CFU/g，與LAMP-AGE檢測(cè)靈敏度相同，是傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法的100倍。此方法具有強(qiáng)特異性和高靈敏度，不需要使用精密昂貴的試驗(yàn)設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，可應(yīng)用于其他微生物檢測(cè)、診斷等領(lǐng)域。