基于SSR分子標(biāo)記的普通絲瓜雜交種子純度鑒定

朱海生 李祖亮 李永平 劉建汀 王彬 陳敏氡 溫慶放

摘要：為了建立一種高效、準(zhǔn)確的普通絲瓜品種純度檢測(cè)方法，以普通絲瓜絲盛2號(hào)及其親本為試驗(yàn)材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定雜交種種子純度，從106對(duì)SSR引物中篩選出1對(duì)引物（SGSSR4），其在雜交種和雙親之間存在顯著差異條帶，且雜交種含有父、母本的特異互補(bǔ)帶型。利用該引物對(duì)26株絲盛2號(hào)雜交種進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果為96.15%，與大田種植鑒定結(jié)果一致，表明該引物可用于絲盛2號(hào)雜交一代種子純度的快速檢測(cè)和準(zhǔn)確鑒定。

關(guān)鍵詞：普通絲瓜;ISS分子標(biāo)記;種子純度;鑒定

中圖分類號(hào)： S642.403.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）08-0053-03

收稿日期：2019-04-03

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2019J011112）;福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目-省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（編號(hào)：2018R1026-5）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“青年科技英才百人計(jì)劃”（編號(hào)：YC2017-5）;中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)（編號(hào)：2018L3005）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：STIT2017-1-2）;國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福州綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-23-G-53）。

作者簡(jiǎn)介：朱海生（1978—），男，安徽樅陽(yáng)人，博士，研究員，主要從事蔬菜生物技術(shù)與育種方面的研究。E-mail：zhs0246@163.com。

絲瓜（Luffa cylindrica）起源于印度，主要分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Luffa Mill.）一年生攀緣藤本植物，是我國(guó)最主要的瓜類蔬菜之一，在我國(guó)各地均有大面積栽培[1]。絲瓜屬主要有8個(gè)種，普通絲瓜（俗稱肉絲瓜）是其中最為重要的栽培種之一，我國(guó)大部分地區(qū)以栽培普通絲瓜為主[2-3]。普通絲瓜肉質(zhì)清香軟滑，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，同時(shí)具有天然保健及藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，其栽培面積和需求量正在不斷增大，具有巨大的經(jīng)濟(jì)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。利用雜種優(yōu)勢(shì)，培育一代雜交絲瓜品種是目前普通絲瓜育種的主要方法。由于在普通絲瓜雜交制種過(guò)程中，人工去雄不徹底或漏去雄等原因，常會(huì)出現(xiàn)假雜交種，導(dǎo)致種子遺傳純度降低，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，雜交種品種純度和種子真實(shí)性準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速鑒定成為普通絲瓜生產(chǎn)中最為迫切解決的問(wèn)題之一。

分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使從DNA分子水平上對(duì)品種純度進(jìn)行基因鑒定和分析成為可能。采用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定是一種快速、便捷、準(zhǔn)確、有效的方法。微衛(wèi)星序列即簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記，廣泛存在于真核和原核生物基因組中。SSR分子標(biāo)記具有重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠、位點(diǎn)特異、復(fù)等位、呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為最為廣泛的分子標(biāo)記之一[4-5]，也是目前作物品種鑒定和種子純度鑒定研究中最常用的標(biāo)記之一[6-7]。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出特異性SSR引物，建立了一套快速檢測(cè)普通絲瓜種子純度的方法，以期為準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)單高效的普通絲瓜雜交種子純度鑒定提供參考。

1?材料與方法

1.1?普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與SSR分子標(biāo)記篩選

普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于筆者所在課題組Illumina高通量深度測(cè)序結(jié)果。委托基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用Primer 3.0對(duì)含SSR位點(diǎn)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列長(zhǎng)度18～25 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～280 bp，GC含量40%～60%，退火溫度55～65 ℃，隨機(jī)選擇其中20 bp以上SSR序列的150對(duì)標(biāo)記進(jìn)行合成，進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證其有效性。

1.2?材料及其DNA提取

供試材料為普通絲瓜絲盛2號(hào)雜交種及其父母本，為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育品種?；蚪MDNA提取采用CTAB法進(jìn)行[8]，選取2～3張嫩葉，加入1～2勺的PVP和液氮，迅速研磨成粉狀，移入1.5 mL的離心管后加入600 μL預(yù)熱至65 ℃的2% CTAB Buffer和7 μL β-巰基乙醇，充分混勻后，65 ℃ 水浴1 h，期間多次搖勻;室溫冷卻后三氯甲烷等體積的加入三氯甲烷/異戊醇，混勻靜置10 min，在 12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min;取上清液，加入100 μL 3 mol/L NaAc和300 μL的三氯甲烷/異戊醇充分混勻，離心10 min;再次取上清液，并加入0.6倍體積異丙醇，混勻至能看到白色絮狀物，在 12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，75%乙醇洗滌DNA 2～3次，風(fēng)干后的DNA溶于100 μL TE溶液，加入2.5 μL RNase A去除RNA，保存于4 ℃或 -20 ℃ 備用。

1.3?普通絲瓜雜交種絲盛2號(hào)純度鑒定SSR特異引物的篩選

以絲盛2號(hào)雜交種及其父母本為模板，利用“1.1”節(jié)篩選的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選能區(qū)分絲盛2號(hào)雜交種及其父母本的特異性引物。

PCR擴(kuò)增時(shí)采用的反應(yīng)體系：75 ng基因組DNA 1 μL，0.2 mmol/L dNTP 1 μL，500 u Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol/L的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入滅菌的超純水至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：先在95 ℃預(yù)變性5 min;接下來(lái)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃ 下延伸30 min;最后72 ℃下延伸7 min，反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離后觀察拍照分析。

1.4?普通絲瓜雜交種絲盛2號(hào)純度鑒定

隨機(jī)抽取絲盛2號(hào)雜交種，利用篩選出來(lái)的SSR特異引物進(jìn)行鑒定，結(jié)合田間種植鑒定結(jié)果，驗(yàn)證利用SSR分子標(biāo)記鑒定種子純度的準(zhǔn)確性。只有同時(shí)具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計(jì)算種子純度。

2?結(jié)果與分析

2.1?普通絲瓜DNA提取與鑒定

應(yīng)用改良后CTAB法提取的DNA，通過(guò)濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：DNA條帶清晰，拖帶現(xiàn)象不明顯，帶形集中。D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，表示所提取的DNA雜質(zhì)含量少，純度較高，適合于做進(jìn)一步研究（圖1）。

2.2?普通絲瓜SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)來(lái)源與篩選

普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組經(jīng)組裝后共獲得58 073條Unigene，利用MISA工具進(jìn)行搜索，其中6 916條Unigene序列中含有7 478個(gè)SSR位點(diǎn)。對(duì)含SSR位點(diǎn)的6 916條Unigene序列利用Primer 3.0設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)出SSR引物7 563對(duì)。選取長(zhǎng)度在 20 bp 以上的SSR序列，合成長(zhǎng)度18～25 bp、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～280 bp的引物150對(duì)，進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增有效性檢測(cè)。SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，106對(duì)SSR引物實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，且?guī)颓逦?、重?fù)性好（圖2）。

2.3?SSR特異引物篩選

利用篩選出的106對(duì)有效擴(kuò)增SSR引物對(duì)絲盛2號(hào)雜交種及其父母本進(jìn)行PCR擴(kuò)增及特異引物篩選。篩選到共顯性標(biāo)記的引物SGSSR4

（SGSSR4-F：5′-AGGGGTTAGTCGACCGATTT-3′;SGSSR4-R：5′-TGCTTGCCACTTGAAGAAAC-3′）。引物SGSSR4能同時(shí)產(chǎn)生父本和母本特異性標(biāo)記，并在絲盛2號(hào)雜交種中擴(kuò)增出互補(bǔ)條帶（圖3），表明該對(duì)引物可用于絲盛2號(hào)種子純度的檢測(cè)。

2.3?雜交種純度鑒定

從田間隨機(jī)選取26株絲盛2號(hào)普通絲瓜，利用篩選得到的特異性引物對(duì)SGSSR4進(jìn)行純度檢測(cè)，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，25株能清晰地?cái)U(kuò)增出與親本互補(bǔ)的條帶，擴(kuò)增出父本特異條帶各1株（圖4），種子純度為96.15%，與田間檢測(cè)結(jié)果一致。

3?討論與結(jié)論

近些年隨著分子標(biāo)記技術(shù)的深入研究，使得分子標(biāo)記技術(shù)成為鑒定普通絲瓜種子純度的快速、準(zhǔn)確的方法。基于轉(zhuǎn)錄組的SSR分子標(biāo)記較一般的分子標(biāo)記具有信息量大、通用性好、在基因組序列中分布廣泛等優(yōu)勢(shì)，在雜交種的鑒定和種子純度檢測(cè)方面具有很大優(yōu)越性，已在多種植物中廣泛應(yīng)用[9-10]?，F(xiàn)有的普通絲瓜SSR分子標(biāo)記數(shù)量有限，

大量開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記仍是目前普通絲瓜研究的重要工作之一。本研究利用普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的SSR標(biāo)記，篩選出能有效擴(kuò)增，且?guī)颓逦⒅貜?fù)性好的SSR引物，為后期普通絲瓜雜交種子純度鑒定提供了參考。

鑒于采用傳統(tǒng)的田間性狀鑒定技術(shù)鑒定種子純度周期長(zhǎng)、成本高、工作量大，且以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù)，易受外界環(huán)境和檢測(cè)人員水平等因素影響，導(dǎo)致結(jié)果存在偏差[11]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)直接反映不同品種的遺傳基礎(chǔ)差異，為植物品種種子純度鑒定提供了一種更準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、高效的方法。SSR標(biāo)記數(shù)量多，具有很高多態(tài)性，帶型易于區(qū)分判斷，能區(qū)分純合基因型和雜合基因型，是一項(xiàng)很有潛力的技術(shù)，在黃瓜[12]、青花菜[13]、甘藍(lán)[14]等蔬菜中都有相關(guān)報(bào)道，但是利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定品種種子純度時(shí)，前提條件是能夠準(zhǔn)確篩選出能在雙親中清晰、特異擴(kuò)增的條帶。本研究從106對(duì)引物中篩選出1條特異性強(qiáng)的引物SGSSR4，引物SGSSR4能同時(shí)產(chǎn)生父本和母本特異性標(biāo)記，可將普通絲瓜雜交種子與其父母本區(qū)分開(kāi)來(lái)，快速檢測(cè)出雜交種子的純度，具有準(zhǔn)確、低成本、操作方便等優(yōu)勢(shì)，能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值，為普通絲瓜種子質(zhì)量控制和純度鑒定提供了參考依據(jù)。

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