羅漢果分子生物學(xué)研究進展

唐美瓊 李剛 胡營 覃芳 閆志剛 韋榮昌

摘要：羅漢果是廣西著名的道地藥材，也是我國特有的藥食兩用植物，具有重要的藥用價值和開發(fā)前景。近年來，羅漢果分子生物學(xué)的研究涉及羅漢果種質(zhì)資源鑒定、功能基因克隆、抗病性育種等方面，這些技術(shù)研究內(nèi)容主要包括羅漢果性別鑒定、遺傳多樣性、轉(zhuǎn)錄組特征及功能基因克隆等。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已實現(xiàn)了羅漢果幼苗性別鑒定，全面揭示了其遺傳多樣性及品種間的親緣關(guān)系;通過構(gòu)建羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，促進了對該植物的果實生長發(fā)育和代謝調(diào)控相關(guān)功能基因的研究;利用RNAi技術(shù)有望獲得抗病毒病的羅漢果轉(zhuǎn)基因植株。今后可利用羅漢果基因組數(shù)據(jù)，深入挖掘基因資源，研究候選基因的功能，明確羅漢果果實生長發(fā)育過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用基因工程手段促進羅漢果種質(zhì)資源開發(fā)及分子遺傳育種發(fā)展。

關(guān)鍵詞：羅漢果;分子標(biāo)記;遺傳差異;基因克隆;轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：S567.901文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0013-05

收稿日期：2019-03-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81860678）;廣西自然科學(xué)基金（編號：2017GXNSFAA198232、2015GXNSFBA139149、2017GXNSFAA198280、2016GXNSFAA380174、2015GXNSFBA139134）。

作者簡介：唐美瓊（1984—），女，廣西全州人，碩士，助理研究員，主要從事藥用植物遺傳育種研究。E-mail：tangmeiqiong2006@163.com。

通信作者：韋榮昌，博士，高級工程師，主要從事生藥學(xué)研究。E-mail：wrc830612@163.com。

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科羅漢果屬多年生藤本植物，是我國特有的藥食兩用植物，主要產(chǎn)于廣西桂北地區(qū)[1]。羅漢果以果實入藥，味甘，性涼，具有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便[2]和抗癌[3]等功效。羅漢果應(yīng)用廣泛，除用作飲片外，僅以羅漢果冠名的中成藥就有幾十種。近年來，隨著羅漢果提取物市場需求的急劇增加，羅漢果成為產(chǎn)量增長最快的中藥品種之一。

長期以來，人們對羅漢果的研究主要集中在地理分布[4]、主栽品種[5]、繁殖技術(shù)[6]、化學(xué)成分[7]、藥理作用[8]和開發(fā)利用[9]等方面。近年來，國內(nèi)外學(xué)者將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到羅漢果性別鑒定、遺傳差異分析、功能基因克隆及抗病毒等研究中，取得了一些重要進展。本文就羅漢果分子生物學(xué)方面的最新研究進展進行綜述，為開展羅漢果的分子育種提供參考。

1?羅漢果性別性狀的遺傳標(biāo)記

羅漢果雌雄異株，須進行人工授粉才能結(jié)實，生產(chǎn)中需要大量的雌株，在未開花之前難以通過形態(tài)特征進行鑒別。DNA分子標(biāo)記技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確和可信度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于雌雄異株植物早期性別分子鑒定研究。目前，用于羅漢果幼苗雌雄鑒別研究的DNA分子標(biāo)記有AFLP和RAPD 2種。

陶莉等建立的AFLP 標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合數(shù)量性狀分析，可以快速經(jīng)濟地鑒別羅漢果幼苗雌雄株[10]。對RAPD標(biāo)記的研究方面，韋弟等發(fā)現(xiàn)S143是1條與雄性連鎖的分子標(biāo)記[11]。黃夕洋獲得4條可用于羅漢果栽培品種性別鑒定的引物（S60、S90、S100、S343、S357）[12]。黃姿梅通過對栽培品種青皮果的雌雄株進行RAPD標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)引物S47和S103能在雄集群DNA池和單株中擴增出雄特異性條帶，引物S43則在栽培品種青皮、長灘、冬瓜和紅毛的雌集群DNA池擴增出雌性特異性條帶[13]。這些研究結(jié)果表明，分子標(biāo)記技術(shù)可以對羅漢果幼苗進行雌雄鑒別。

2?羅漢果種質(zhì)資源的遺傳差異分析

DNA分子標(biāo)記技術(shù)不僅在羅漢果雌雄性別鑒定中發(fā)揮重要作用，而且在羅漢果種質(zhì)資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系以及育種材料的遺傳背景分析等研究方面也展示出廣闊的應(yīng)用前景。

2.1?遺傳多樣性分析

羅漢果在長期的人工栽培及自然選擇過程中，形成了許多優(yōu)良品種及豐富的野生類型。由于生產(chǎn)上長期采用無性繁殖方式，使栽培羅漢果的遺傳結(jié)構(gòu)變的脆弱，嚴(yán)重阻礙了羅漢果種質(zhì)資源的合理利用。

已有大量的研究工作通過采用不同的分子標(biāo)記研究羅漢果不同居群的遺傳結(jié)構(gòu)，并為種質(zhì)資源保護策略的制定提供理論指導(dǎo)。彭云滔等利用ISSR標(biāo)記法對來源地不同的羅漢果野生居群進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)不同居群間的遺傳變異較大[14]。黃江等采用RAPD技術(shù)對羅漢果10個栽培品種和5份野生種質(zhì)進行遺傳分析和鑒定表明，圓果類栽培品種間親緣關(guān)系較近，長果類栽培品種與野生種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，長果類品種與圓果類品種間在親緣關(guān)系上存在明顯差異[15]。周俊亞等用ISSR和RAPD對羅漢果栽培品種進行分析發(fā)現(xiàn)，主要的栽培品種青皮果、紅毛果和爆棚籽的遺傳多樣性很低，而茶山果和冬瓜漢具有較高的遺傳多樣性[16-17]。戴俊采用ISSR和RAPD 對野生和栽培羅漢果進行遺傳差異分析，結(jié)果均顯示野生種質(zhì)的遺傳多樣性高于栽培種質(zhì)[18]。此外，李媛采用15個RAPD引物對4個野生羅漢果種群共351個樣品分布格局及克隆結(jié)構(gòu)進行研究，結(jié)果顯示，野生羅漢果種群具有相對較高的克隆多樣性[19]。這些研究結(jié)果表明，營養(yǎng)繁殖方法是造成栽培羅漢果遺傳多樣性低的主要原因，有必要擴大栽培羅漢果的遺傳基礎(chǔ)。

2.2?育種材料遺傳背景分析

甜苷Ⅴ是羅漢果主要活性成分和甜味成分，由于甜度高（為蔗糖甜度的425倍），熱量低，口感好，從而成為理想的天然甜味劑[20-21]，是糖尿病人、肥胖病人理想的食糖代用品，具有極高的經(jīng)濟價值。研究顯示，甜苷Ⅴ僅僅存在于果肉和果皮中，羅漢果種子數(shù)量多，且不含甜苷Ⅴ[22]，使得羅漢果果實的利用率非常低，大大增加了提取難度和生產(chǎn)成本（圖1）。從分子水平上研究多倍體無籽羅漢果育種材料的遺傳背景，可以克服無籽羅漢果新品系選育中雜交親本選配和組配時的盲目性，提高育種效率。

付偉采用SRAP技術(shù)對羅漢果二倍體和四倍體的基因組水平進行遺傳變異分析，結(jié)果表明羅漢果二倍體及四倍體株系之間基因組DNA的SRAP多態(tài)性較低，遺傳差異較小[23]。韋榮昌等應(yīng)用ISSR技術(shù)對多倍體無籽羅漢果及其親本材料的遺傳背景進行分析，結(jié)果表明，F(xiàn)1代從四倍體母本上繼承的遺傳物質(zhì)更多，遺傳上傾向母本，且F1代與親本之間的平均遺傳相似性系數(shù)大于或小于親本之間，隨親本的組合和相應(yīng)的F1代而定，聚類圖和雙變量主坐標(biāo)表明羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株遺傳背景的復(fù)雜性較低，存在一定的豐富性，體現(xiàn)了“子似親”的遺傳現(xiàn)象[24-25]。該課題組采用RAPD技術(shù)得到同樣的結(jié)果，建議盡快采取相應(yīng)措施，進行羅漢果種質(zhì)創(chuàng)新，以豐富無籽羅漢果親本的遺傳背景[26]。

此外，向巧彥等運用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對空間誘導(dǎo)羅漢果DNA突變進行全基因組檢測和聚類分析發(fā)現(xiàn)，太空環(huán)境可對羅漢果造成誘變效應(yīng)，部分航天種質(zhì)可能獲得了有益突變，可為羅漢果新品種培育和雜交親本選配提供科學(xué)依據(jù)[27]。

2.3?遺傳圖譜構(gòu)建及農(nóng)藝性狀QTL定位

遺傳圖譜即遺傳連鎖圖譜，指基因組中基因及專一的多態(tài)性標(biāo)記之間相對位置的圖譜。覃嘉明利用1個有167個株系的F1代群體，根據(jù)63對引物組合擴增出的131個SRAP多態(tài)性數(shù)據(jù)，構(gòu)建了首張羅漢果遺傳框架圖譜，其中112個SRAP標(biāo)記分屬于23個連鎖群，覆蓋羅漢果基因組總長度725.6 cM，標(biāo)記間平均圖距6.48 cM[28]。劉麗華利用ISSR和SRAP對以羅漢果野生紅毛一號為母本、長灘果為父本雜交獲得的150株F1子代單株作圖群體進行遺傳學(xué)分析，得到1張包含203個標(biāo)記的羅漢果遺傳圖譜，其中有29個ISSR標(biāo)記、173個SRAP標(biāo)記和1個性別標(biāo)記，包含27個連鎖群，圖譜總長度1 474.1 cM，圖譜覆蓋率為65.2%，連鎖群長度在19.5～152.6 cM之間，平均長度54.6 cM[29]。運用軟件Windows QTL Cartographer V2.5的復(fù)合區(qū)間作圖法獲得與農(nóng)藝性狀相關(guān)的QTLs位點33個。這些研究結(jié)果為羅漢果改良應(yīng)用提供了有價值的科學(xué)依據(jù)。

3?羅漢果的功能基因研究

羅漢果分子生物學(xué)研究主要集中在分子標(biāo)記應(yīng)用、組織培養(yǎng)等方面。2011年，Tang等應(yīng)用Solexa高通量測序技術(shù)對授粉后3、50、70 d的羅漢果果實進行轉(zhuǎn)錄組測序和表達譜分析，開啟了關(guān)于羅漢果功能基因的研究[30]。

3.1?cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組分析

唐其等以羅漢果授粉后50、70 d果實為材料，利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了羅漢果果實在不同生育時期皂苷生物合成相關(guān)基因的差減cDNA文庫，對隨機挑選的641個cDNA陽性克隆測序，最終獲得622條有效序列，發(fā)現(xiàn)其中421個ESTs序列和能量代謝、次生代謝、轉(zhuǎn)錄因子、衰老及抗病性等蛋白有高度相似性[31]。通過對不同生長時期的羅漢果果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，羅漢果甜苷Ⅴ生物合成途徑中的基因、萜類和甾體2條代謝途徑所有已知關(guān)鍵酶基因基本可以確定[30，32]。甜苷Ⅴ合成有關(guān)的候選基因分屬于角鯊烯環(huán)氧酶、三萜類物質(zhì)合成酶、環(huán)氧化物水解酶、細胞色素P450單加氧酶、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶五大基因家族[33]。轉(zhuǎn)錄組測序也鑒定到了可能參與羅漢果甜苷合成調(diào)控和黃酮類化合物合成調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[34]。趙歡采用轉(zhuǎn)錄組測序和表達譜分析對三倍體無籽羅漢果和二倍體羅漢果果實進行分析，發(fā)現(xiàn)329個基因是二倍體果實所特有，303個基因是三倍體果實所特有，并找出1個編碼T-細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)因子的基因、2個注釋為STP合酶的基因以及2個參與雄性減數(shù)分裂的基因都顯著下調(diào)，推測這幾個基因都可能與雄性不育有關(guān)，該研究結(jié)果從分子水平上加深了對三倍體果實和種子形成的理解，為無籽羅漢果育種研究提供了重要的基因資源[35]。

3.2?功能基因克隆及鑒定

羅漢果的基因克隆主要涉及羅漢果甜苷Ⅴ生物合成途徑及羅漢果生長發(fā)育相關(guān)的生物過程。

羅漢果甜苷Ⅴ屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，而3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）位于甲羥戊酸（MVA）途徑中，是萜類化合物生物合成途徑中的第1個限速酶，是羅漢果甜苷Ⅴ生物合成途徑中的重要調(diào)控位點，sgHMGR在羅漢果中的葉片、莖和果實中的表達差異明顯，在果實中與甜苷Ⅴ合成積累變化規(guī)律相似[36-37]。角鯊烯合成關(guān)鍵酶角鯊烯合酶（SQS）、葫蘆二烯醇合酶（CS）、環(huán)阿喬醇合酶（CAS）基因均已被克隆，生物信息學(xué)信息、時空表達規(guī)律及亞細胞定位等已經(jīng)開展研究[35]。以色列科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，甜苷Ⅴ產(chǎn)生于細胞質(zhì)中的MVA途徑。來源于該途徑的異戊二烯焦磷酸（IPP）與牻牛兒基焦磷酸（GPP）在法尼基焦磷酸合酶（FPS）的催化下形成法尼基焦磷酸（FPP），F(xiàn)PP在角鯊烯合酶（SQS）的作用下頭尾結(jié)合成為角鯊烯，角鯊烯環(huán)氧化酶（SQE）2次作用將角鯊烯催化成2，3;22，23-二環(huán)氧化角鯊烯，經(jīng)葫蘆二烯醇合酶（CS）催化形成環(huán)氧葫蘆二烯醇，經(jīng)環(huán)氧化物酶催化形成二羥基葫蘆二烯醇，接著在CYP102801的作用下形成羅漢果醇。羅漢果醇在UGT720-269-1的連續(xù)作用下逐步形成羅漢果苷Ⅰ-A1和羅漢果苷ⅡE，接著在UGT94-289-3的持續(xù)作用下又形成羅漢果苷Ⅲx、羅漢果苷Ⅳ-A和賽門苷，最終合成甜苷Ⅴ[33]（圖2）。

羅漢果雌雄異株，在栽培中需要進行人工授粉才能正常結(jié)實，嚴(yán)重制約了羅漢果種植業(yè)的發(fā)展，選育單性結(jié)實雌性系或者可自花授粉的兩性花品種，是羅漢果生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題。生長素類物質(zhì)調(diào)控植物生長發(fā)育和器官的形態(tài)發(fā)生，目前，已有關(guān)于羅漢果中與生長素合成與調(diào)控相關(guān)基因研究的報道。例如，羅漢果中可能與生長素極性運輸及果實起始發(fā)育迅速發(fā)生密切相關(guān)的sgNPY2基因的克隆與表達研究[38];參與羅漢果生長發(fā)育調(diào)節(jié)過程，尤其與雌蕊和幼果的器官形態(tài)建成密切相關(guān)的生長素響應(yīng)因子sgARF8的鑒定[39];直接參與植物生物素合成途徑的關(guān)鍵基因sgTAR2的克隆與表達分析[40]。周瓊等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建果實特異啟動子2A11與生長素合成相關(guān)基因iaaM的嵌合基因（2A11-iaaM）過表達載體，轉(zhuǎn)羅漢果后得到5株在田間正常開花的陽性植株，并表現(xiàn)單性結(jié)實[41]。乙烯合成酶sgACS1基因[42]和sgACS3基因[43]可能參與花芽的形成、雌蕊原基分化、蕾中雄蕊發(fā)育以及雌花形成。這些結(jié)果對研究生長素調(diào)控羅漢果發(fā)育和器官形態(tài)發(fā)生的分子機制具有重要意義。

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