數(shù)字PCR在食品安全檢測中的應(yīng)用研究進展

張宜文，趙海波,吳 紅，馬 康

(1.北京市計量檢測科學(xué)研究院，北京 100021；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100013)

隨著我國與世界各國食品領(lǐng)域貿(mào)易合作的不斷深化，食品安全成為各國監(jiān)管和市場競爭的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)基因生物的多樣化帶來了轉(zhuǎn)基因基質(zhì)的復(fù)雜性及其檢測的挑戰(zhàn)性[1]，全球農(nóng)業(yè)種植中涉及30多種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其交易額逐年上升[2]。國際食品貿(mào)易中由于食品動植物源成分摻雜或失信導(dǎo)致的損失每年高達400億美元[3-4]。全球范圍內(nèi)豐富的微生物種類(細菌、病毒、支原體等)及構(gòu)型，以及感染宿主的多樣化讓檢測變得復(fù)雜化，從而突顯了非培養(yǎng)宿主式相對快速的檢測方法的優(yōu)勢[5-6]。為降低生產(chǎn)、運輸、銷售、儲存等各環(huán)節(jié)的食品安全風(fēng)險和提高監(jiān)管效率，食品監(jiān)管部門對快速檢測方面的需求增強，使得聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在食品安全領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用與發(fā)展。

食品自身種類的廣泛性、差異性和基體復(fù)雜性促使其檢測理論和方法不斷改進和優(yōu)化。目前食品檢測領(lǐng)域的化學(xué)儀器技術(shù)包括色譜[7-8]、電化學(xué)[9]、光譜[10]、質(zhì)譜[11]、核磁[12]以及多種串聯(lián)技術(shù)[13]和生物傳感器[14]等(圖1)。這些方法廣泛應(yīng)用于食品檢測的各個領(lǐng)域，在分離、鑒別、表征等方面有著顯著優(yōu)勢，但存在前處理步驟多、復(fù)雜食品基體回收率低和設(shè)備昂貴等問題。食品檢測的生物技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫(ELISAs)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等技術(shù)，其中ELISAs是最常見的食品分析方法，但其對于實驗環(huán)境和樣品狀態(tài)的要求較高。PCR方法可以突破對實驗環(huán)境以及食品基體的局限性，在轉(zhuǎn)基因成分檢測、動植物源摻雜、微生物檢驗方面可保持待測核酸分子的穩(wěn)定性，識別特異性好，靈敏度高，已得到了廣泛應(yīng)用。圖1中列出了食品分析技術(shù)的類別以及相關(guān)類別下的主流分析工具，圖中虛線所包含區(qū)域內(nèi)的儀器是相應(yīng)分析對象的主要使用儀器。

圖1 食品分析技術(shù)的類別、分析工具以及分析對象Fig.1 Main analytical categories,techniques and objects in food analysisPCR:qPCR(熒光PCR),dPCR(數(shù)字PCR),PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)),LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù)),HRM(高分辨熔解曲線分析技術(shù));ELISA:ICGT(膠體金試紙條檢測技術(shù)),RIA(放射免疫技術(shù)),FIA(熒光免疫技術(shù)),TRFIA(時間分辨熒光免疫分析),CLIA(化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)),SELEX(指數(shù)富集適配體系統(tǒng)進化技術(shù)) ;LC/GC(液相/氣相色譜技術(shù));LC/GC/ICP MS(液相/氣相/電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù));PTR-MS(質(zhì)子轉(zhuǎn)移質(zhì)譜技術(shù));TIMS(熱電離質(zhì)譜技術(shù));DART-MS(實時直接分析質(zhì)譜技術(shù));IR(紅外光譜分析技術(shù));Raman(拉曼光譜分析技術(shù));UV/FS(紫外可見/熒光光譜分析技術(shù))；AAS(原子吸收分光光譜分析技術(shù))；ICP(電感耦合等離子體光譜分析技術(shù))；XRF(X射線熒光光譜分析技術(shù));NMR(核磁波譜分析技術(shù))

1 PCR原理

PCR技術(shù)通過對核酸分子進行變性、復(fù)性、延伸3個步驟的不斷循環(huán)，使目標分子呈指數(shù)倍數(shù)的增長，從而使微量、痕量的核酸達到可檢測水平。目前PCR技術(shù)主要可分為傳統(tǒng)PCR(cPCR)、熒光PCR(qPCR)和數(shù)字PCR(dPCR)三代，并在此基礎(chǔ)上建立了相關(guān)的食品檢測方法，三代PCR的工作原理如圖2所示。

圖2 3種PCR的工作原理Fig.2 Work flow of three polymerase chain reactorsA.cPCR ；B.qPCR；C.dPCR

cPCR分析儀通過控制反應(yīng)溫度，使待測核酸分子在不同溫度下變性、復(fù)性、延伸循環(huán)復(fù)制，再對經(jīng)多次復(fù)制后的核酸分子進行凝膠分析，觀察是否出現(xiàn)目標核酸的條帶；qPCR是在cPCR基礎(chǔ)之上，加入特定的熒光染料，其熒光強度與擴增后和染料結(jié)合的核酸分子的數(shù)量相關(guān)，通過終端PC可以實時顯示擴增的狀態(tài)。對比擴增后的熒光值與初始設(shè)定熒光強度，可得到待測核酸的閾值(Ct)，將Ct值代入到已知含量DNA的標準曲線，計算得到待測核酸的 DNA分子含量[15]；dPCR技術(shù)是將qPCR體系等量均分到相互隔離的大數(shù)量(多數(shù)大于10 000個)微小的反應(yīng)單元(芯片微孔或微滴液珠)中，且理想狀態(tài)下一個反應(yīng)體系中至多包含一個待測核酸分子。dPCR的反應(yīng)過程與qPCR相似，擴增后的核酸分子在熒光下顯示熒光信號(表示為“1”)，或沒有熒光信號(表示為“0”)，通過泊松分布對熒光信號“0”和“1”進行統(tǒng)計分析，即可實現(xiàn)對核酸含量的測定。dPCR不需要建立標準曲線，無需通過Ct值進行濃度比較，被認為是一種絕對定量的方法[16]。而且由于dPCR的反應(yīng)效率和精密度受食品基質(zhì)干擾的影響較小，理論上dPCR可以對所有可應(yīng)用于qPCR的檢測對象進行分析。

2 三代PCR相關(guān)標準進展

自2003年以來，我國食品監(jiān)管相關(guān)部門分別針對動物源、植物源、微生物和轉(zhuǎn)基因食品制定了相應(yīng)的檢測標準和方法。本文統(tǒng)計了2003年至2019年6月現(xiàn)行有效的PCR相關(guān)標準，并比較了cPCR、qPCR和dPCR相關(guān)標準在檢測對象(表1)和實施年份、標準數(shù)量(圖3)上的差異。

表1 食品中基于PCR分析的主要分析物比較Table 1 Comparison of major analytes in food based on PCR analysis

the relevant standards in this paper include the national,industrial and local standards related to PCR technology in food(本文涉及的“我國相關(guān)標準”均包括食品中PCR技術(shù)相關(guān)的國家標準、行業(yè)標準和地方標準);FAO( Food and Agriculture Organization of the United Nations,聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織糧農(nóng)組織),FDA(Food and Drug Administration,食品藥品監(jiān)督管理局),WHO(World Health Organization,世界衛(wèi)生組織)

圖3 cPCR、qPCR和dPCR國內(nèi)標準對比Fig.3 Comparison of domestic standards for cPCR,qPCR and dPCRA.classification by number of detection types in standard(標準中按檢測類型數(shù)量分類),B.comparing cPCR,qPCR and dPCR to classify the number of detected objects(cPCR、qPCR、dPCR檢測對象數(shù)量分類),C.standards of cPCR,qPCR and dPCR in different years(不同年度的cPCR、qPCR、dPCR標準情況),D.proportion of cPCR,qPCR and dPCR in total standard quantity(cPCR、qPCR、dPCR在總標準數(shù)量中的比例)

與國際標準相比，我國相關(guān)標準類別[17]種類匹配和分析物數(shù)量更為全面(表1)，F(xiàn)DA[18]和FAO/WHO[19]僅提供了較為有限數(shù)量的目標分析物。進一步對比這些分析物在檢測方法上的差異，發(fā)現(xiàn)基于PCR方法的轉(zhuǎn)基因和微生物是占比較大的兩類(圖3A)，目前的標準以cPCR和qPCR方法為主(圖3D)，qPCR方法在動植物源的檢測中占比最大，cPCR在轉(zhuǎn)基因的定性篩選方面成本較低，標準數(shù)量較多(圖3B);近年來基于dPCR技術(shù)的標準有所增加(圖3C)，其在轉(zhuǎn)基因、微生物和動植物源檢測相關(guān)標準方面的數(shù)量分別為11種、8種、0種，而目前dPCR技術(shù)可為更多目標分析物的研究提供可靠性依據(jù)，為建立更多的dPCR檢測方法提供了支持。

3 數(shù)字PCR(dPCR)在食品分析中的應(yīng)用進展

近年來dPCR在轉(zhuǎn)基因、動植物源和微生物檢測方面的應(yīng)用，以及dPCR和qPCR對不同分析物檢測方法的比較研究成為熱點。以下對dPCR在上述相關(guān)檢測方面的研究進行了總結(jié)。

3.1 轉(zhuǎn)基因檢測

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因生物的普及，轉(zhuǎn)基因生物面臨著越來越多的食品安全相關(guān)的社會壓力，制定合理的標準以及提供可靠的檢測方法對規(guī)范轉(zhuǎn)基因食品有著重要的意義。常見的轉(zhuǎn)基因作物有抗除草劑類和抗蟲類，具體見表2。

目前常用的轉(zhuǎn)基因檢測方法為傳統(tǒng)PCR定性分析以及qPCR定量分析。qPCR和dPCR可用于轉(zhuǎn)基因元件或品系的定量檢測。qPCR結(jié)果受轉(zhuǎn)基因核酸含量及基質(zhì)影響偏大，而dPCR受此影響較小，因而更適合待測物中微量轉(zhuǎn)基因的檢測，且有較好的靈敏度和拷貝數(shù)分辨精度[20]。Kosir等采用多重dPCR轉(zhuǎn)基因檢測方法對同一樣本中的內(nèi)、外源基因進行同時檢測，避免了多次取樣的誤差，并且使得操作更加簡單，大大縮短了檢測時間[21]。

表2 數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因檢測方法及使用材料Table 2 Digital PCR detection of transgenic genes and material used

(續(xù)表2)

*ddPCR:droplet digial PCR(微滴數(shù)字PCR)；cdPCR：camber digital PCR(微孔數(shù)字PCR)

3.2 動物源摻雜

動物源和植物源的摻雜檢測是基于DNA檢測的另一重要應(yīng)用方向。肉制品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中有意或無意摻雜未標明的肉類成分已成為全球面臨的食品安全熱點問題。在動物源摻雜的報道[50]中，不僅存在在高價格的肉制品(如豬肉、牛肉、羊肉)中摻雜廉價肉制品(如雞肉、鴨肉等)的情況，更有直接加入一定比例的低價肉制品的現(xiàn)象。這些未標明的肉制品成分不僅損害了消費者的利益，而且?guī)硎称钒踩[患。

數(shù)字PCR可為動物源成分的精確定量及準確區(qū)分摻雜提供解決途徑。其定量方式可分為兩種：一種方法是通過數(shù)字PCR測定動物源成分的準確拷貝數(shù)，計算得到拷貝數(shù)與樣本質(zhì)量的比例數(shù)(用%表示)。然后通過與目標動物源成分的標準比例數(shù)比較，判斷待測樣品中所含目標動物源成分的摻雜情況。這種方法需要建立龐大的拷貝數(shù)/質(zhì)量標準庫，且不同種類的肉制品拷貝數(shù)與質(zhì)量的比例數(shù)差異較大；另一種方法是直接用拷貝數(shù)比例數(shù)據(jù)作為判別摻雜的依據(jù)，即從不同種類動植物組織或含有動植物的食品中提取核酸后，測算單位質(zhì)量各個種類的目標基因拷貝數(shù)比值，建立基因拷貝數(shù)與質(zhì)量之間的關(guān)系，利用該比例關(guān)系(轉(zhuǎn)換因子)換算出可能的不同種類物質(zhì)添加量，從而實現(xiàn)動植物源性成分的定量檢測。

Qiang等[47]對5種不同種類的山羊和綿羊肉類中24種肉制品摻雜進行分析，檢測限達1copy/μL(山羊)和5copies/μL(綿羊)，且在多種肉類摻雜中特異性表現(xiàn)良好。任君安[48]采用四重、五重數(shù)字PCR分析羊肉中的4種摻雜肉類成分，并發(fā)現(xiàn)反應(yīng)進行程度受溫度、壓力等環(huán)境影響較小，數(shù)字PCR方法的線性范圍寬(摻雜率1%～90%)，相對標準偏差小于25%。

Koppel等[49]通過將肉制樣品和與其相似的參考物質(zhì)用轉(zhuǎn)換因子聯(lián)系起來，將數(shù)字PCR得到的拷貝數(shù)通過轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換成質(zhì)量百分比，對豬肉和牛肉的摻雜進行了分析。在隨后的工作中，Koppel等基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)同時檢測了牛肉、豬肉、雞肉、火雞、綿羊和馬肉6種肉制品在煮熟香腸基質(zhì)中的比例，使用6家實驗室的環(huán)形比對得到的每種肉制品的平均轉(zhuǎn)換因子進行轉(zhuǎn)換后，取得待測香腸肉制品中添加的6種肉的比例估計。與實時PCR結(jié)果相比(不確定度30%)，數(shù)字PCR具有較高的準確性(不確定度10%)[50]。

王強等[51]對9種鵝肉及其他21種添加肉制品進行了檢測，通過將實測數(shù)字PCR拷貝數(shù)代入樣品質(zhì)量與靶基因拷貝數(shù)，得到方法檢出限為LOD95%為1 copy/μL。Noh等[52]將微滴數(shù)字PCR用于混合魚醬產(chǎn)品中阿拉斯加狹鱈魚(Gadus chalcogrammus)的定量分析，混合樣品重量與DNA濃度的關(guān)系無顯著性差異，實驗偏差較低。上述研究表明ddPCR在混合樣品的檢測中具有較好的準確性。

3.3 植物源摻雜

與動物源相類似，植物源食品也存在成分摻雜的情況。楊碩等[53-54]從植物組織或植物蛋白飲料中提取核酸后，進一步對比了椰子汁中的大豆和花生成分，并使用熒光實時PCR和數(shù)字PCR同時對6組樣品進行測定，結(jié)果表明數(shù)字PCR結(jié)果具有較好的準確性，可以減少假陽性幾率。劉二龍等[55]對紅薯中的紫薯、木薯、馬鈴薯、藕、芋頭、豌豆、高粱、胡羅卜、番茄、大米、大豆和大麥作物等12種摻雜成分進行了測定，可對質(zhì)量百分比為5%以上的紅薯成分進行定量測定，精密度(RSD)≤25%，檢出限(LOD)為2.53 copies/μL。

3.4 微生物檢測

病原微生物是食品安全檢測中常見的致病因素，包括細菌、病毒和支原體等。傳統(tǒng)分析方法有基體培養(yǎng)鏡檢、免疫方法和分子方法。與這些方法相比，數(shù)字PCR分析時間更短且不因基質(zhì)中組成成分產(chǎn)生抑制反應(yīng)，檢測靈敏度高。目前已有報道使用數(shù)字PCR技術(shù)對沙門桿菌[56-57]、金黃色葡萄球菌[58]、李斯特氏菌[59]、副溶血性弧菌[60]、豬圓環(huán)病毒[61-62]等常見微生物進行了方法學(xué)驗證，并制定了相關(guān)的數(shù)字PCR方法行業(yè)檢測標準。董蓮華等[63]建立了大腸桿菌E.coliO157:H基因組DNA微滴數(shù)字PCR檢測體系，對5株非大腸桿菌和5株大腸桿菌O517:H7血清型的菌株基因組DNA 進行了方法特異性驗證，并對豬肉、牛肉、雞肉等13份市售肉制品進行E.coliO157:H檢測，測得結(jié)果與熒光PCR方法一致。方佩佩等[64]以不耐熱溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)為靶基因建立了17種混合菌種微滴數(shù)字PCR技術(shù)方法，測定了鱈魚中的副溶血性弧菌含量，方法特異性良好，檢測時間由稀釋培養(yǎng)計數(shù)(Most probable number,MPN)定量方法的3～5 d縮短至3～5 h。

Nshimyimana[65]及Staley[66]等使用微滴數(shù)字PCR對微生物來源進行測定，結(jié)果表明數(shù)字PCR具有更好的特異性及靈敏度，是一種合適的測定微生物來源的方法。Palumbo等[67]在葡萄和葡萄干的生產(chǎn)過程中利用幾種真菌毒素的鈣調(diào)蛋白基因序列差異，使用數(shù)字PCR技術(shù)對赭曲霉毒素A進行監(jiān)測，所得葡萄不同生長時期、不同葡萄種植園的數(shù)字PCR監(jiān)測數(shù)據(jù)可提供該地區(qū)的實時情況，并預(yù)測后期的生長、豐收情況。

Liu等[68]證明熒光PCR和數(shù)字PCR在柑橘黃脈清除病毒(CYVCV)的檢測中均具有較好的線性，但數(shù)字PCR具有更好的靈敏度，是熒光PCR的100倍。Jahne等[69]利用熒光PCR和微滴數(shù)字PCR測定了中水和廢水中的諾如病毒和腺病毒，結(jié)果顯示微滴數(shù)字PCR的靈敏度(中水中GⅡ型諾如病毒檢測靈敏度4%，腺病毒檢測靈敏度 14%)高于熒光PCR，與前期相關(guān)文獻報道一致[70]。Morella等[71]在對病毒(噬菌體)的研究中，認為微滴數(shù)字PCR是一種更快速、低消耗、高通量的檢測方法，建議廣泛應(yīng)用在噬菌體的檢測中。

Maheshwari等[72]使用數(shù)字PCR和熒光PCR方法對柑橘類中支原體檸檬螺旋體的SP1和ORF1基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)對于SP1，數(shù)字PCR的檢測靈敏度(0.000 01 ng)高于熒光PCR(0.000 1 ng)，兩種方法檢測ORF1的靈敏度相同。Bahder等[73]對棕櫚樹中的16SrIV-A和16SrIV-D 型植原體進行數(shù)字PCR(TaqMan)檢測，同時與熒光PCR和巢式PCR(nested PCR，nPCR)進行對比。結(jié)果表明，數(shù)字PCR擁有更低的檢出限，在0.000 1%原始提取液稀釋液中檢出目標物，而熒光PCR在0.1%原始提取液稀釋液中檢出，巢式PCR在0.01%原始提取液稀釋液中檢出(同位素稀釋方法定量)。

4 結(jié)論與展望

文獻整理和分析表明，數(shù)字PCR技術(shù)適用于轉(zhuǎn)基因、動植物源和微生物的檢測，具有較高靈敏度，但對于不同分析物，數(shù)字PCR與熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用評價不同，其中數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因、動物源、部分植物源和微生物的文獻報道中具有更高靈敏度以及對抑制成分的抗干擾能力[74]。

但數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用受到方法穩(wěn)定性、儀器操作等多因素的制約，楊冬燕等[75]的研究表明，在廚房廢棄油脂的實驗中，數(shù)字PCR在靈敏度和準確率方面具有優(yōu)勢，但其方法穩(wěn)定性和精密度不及熒光PCR，導(dǎo)致應(yīng)用優(yōu)勢不明顯。因此，與技術(shù)和產(chǎn)業(yè)都相對成熟的熒光PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)仍然有探索和改進的空間。此外，準確定量檢測需要多種標準物質(zhì)的支持[76]，而目前國內(nèi)轉(zhuǎn)基因的標準物質(zhì)較少，無論是研究還是檢測，都需要購買大量國外商用轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)，如歐洲標準物質(zhì)中心(ERM)、歐盟標準局(IRMM)、美國油脂化學(xué)協(xié)會(AOCS)、日本廠商以及一些國外試劑公司的標準品，導(dǎo)致數(shù)字PCR技術(shù)使用成本昂貴，不利于技術(shù)的完善與應(yīng)用。

無需依賴標準曲線絕對定量，以及對低含量核酸樣品檢測的高準確度使數(shù)字PCR技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。目前制約其發(fā)展的因素主要為標準品價格昂貴和缺少標準方法。由于數(shù)字PCR方法與多數(shù)熒光定量PCR方法具有兼容性，使得可用于數(shù)字PCR的目標分析物和適用方法不斷積累，并應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。數(shù)字PCR可與化學(xué)分析方法相互輔助得到趨于完整的信息。未來將有更多的實驗室將數(shù)字PCR方法納入ISO 17025，數(shù)字PCR將應(yīng)用到越來越多的食品安全檢測中并發(fā)揮更加重要的作用。