同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血清中孕酮

薛晉美，孫 光，李會強(qiáng)，那 平，喬 斌*

(1.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350；2.天津市公安醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300042；3.天津醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)學(xué)院，天津 300203)

孕酮(Progesterone)又稱黃體酮，是一種具有重要生物活性的類固醇激素，其在非孕期女性體內(nèi)主要由卵巢黃體分泌，孕期女性主要由胎盤分泌，在內(nèi)分泌、生殖、經(jīng)期過程方面起關(guān)鍵調(diào)控作用。其在男性體內(nèi)主要在促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)控下由腎上腺分泌[1]。作為一種神經(jīng)類固醇，孕酮在大腦神經(jīng)方面也有重要的信號調(diào)節(jié)功能[2]。成年女性血清中的孕酮濃度通常在0.15～25 ng/mL之間，孕期約升高至230 ng/mL[3]；男性和更年期女性體內(nèi)的孕酮濃度較低，在1～3 nmol/L之間[2]。血清中的孕酮大多以蛋白結(jié)合形式存在，游離孕酮占總孕酮濃度的比例在2%～10%之間變化，但在正常經(jīng)期女性體內(nèi)游離孕酮的比例保持恒定[3]。血清中孕酮的準(zhǔn)確測定對于黃體功能、宮內(nèi)妊娠、自然流產(chǎn)等的確認(rèn)以及其它疾病的診斷具有重要的臨床意義。

放射免疫測定(RIAs)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)是最常用的激素測定方法[4]。免疫法的靈敏度高，但由于抗體的交叉反應(yīng)、基質(zhì)干擾等因素會存在準(zhǔn)確性差[5-7]、動態(tài)范圍窄[8]等缺陷。此外，孕酮等類固醇激素的檢測方法還有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[9-12]。人血清中孕酮的臨床檢測早期采用同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法(ID GC-MS)，但需進(jìn)行復(fù)雜的衍生化且分析時(shí)間較長[13-14]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ID LC-MS/MS)因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，目前被認(rèn)為是臨床檢測和研究的首選方法。LC-MS/MS法已被開發(fā)用于血清中孕酮的分析[15-17]。美國國家標(biāo)準(zhǔn)研究院(NIST)建立了血清中孕酮的ID LC-MS/MS參考方法[3]，該法準(zhǔn)確可靠，但LC梯度洗脫時(shí)間為40 min，分析時(shí)間大大加長。

本研究建立了一種利用同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ID UPLC-MS/MS)檢測血清中孕酮濃度的方法。采用兩步萃取法,提高了血清樣品中孕酮的回收率;使用簡單的液相色譜分離，運(yùn)行時(shí)間短，靈敏度高，重現(xiàn)性好。該方法適用于同時(shí)檢測大批量樣品，為臨床血清中激素的檢測提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity 超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；渦旋混合儀(MS 3 basic，德國IKA公司)；離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；氮吹儀(艾杰爾飛諾美公司)；分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；可調(diào)量程移液器(0.5～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，德國Eppendorf公司)；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司)。

孕酮標(biāo)準(zhǔn)品(99.2%，中國計(jì)量科學(xué)研究院)；孕酮-D9同位素標(biāo)準(zhǔn)品(98%，美國CFW實(shí)驗(yàn)室);甲醇(HPLC級，德國Merck公司)；正己烷、乙酸乙酯(HPLC級，天津康科德科技有限公司)；30%氨水(LC-MS級，美國Waters公司)；乙酸銨、碳酸鈉(優(yōu)級純，福晨化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品來源

血清樣品來自天津市公安醫(yī)院門診及住院患者，樣本的收集及使用已取得醫(yī)院許可并符合相關(guān)規(guī)定，患者血清樣本共30例，外觀澄清，無溶血、黃疸及脂血，于-80 ℃冷凍保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量(精確至10.00 mg)的孕酮和孕酮-D9標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液，-20 ℃保存。

準(zhǔn)確移取適量內(nèi)標(biāo)儲備液，用甲醇稀釋成10 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，-20 ℃保存。

準(zhǔn)確移取適量孕酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 pg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；將10 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液加入100 μL各系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中，-20 ℃保存。

1.4 樣品制備

移取10 μL孕酮-D9內(nèi)標(biāo)工作溶液至1.5 mL離心管中，用氮?dú)鈱⑷軇┐蹈?，在離心管中分別加入100 μL血清樣品和100 μL乙酸銨(0.5 mol/L)，并在室溫下平衡1 h；用500 μL乙酸乙酯-正己烷(體積比3∶2)進(jìn)行液液萃取(LLE)，渦旋振蕩10 min，13 000 r/min離心2 min后，取上清液以40 ℃氮?dú)獯蹈?；向離心管中加入200 μL碳酸鈉(0.2 mol/L)，再依次加入500 μL正己烷萃取2次，13 000 r/min離心5 min后，合并兩次提取上清液，以40 ℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL甲醇進(jìn)行復(fù)溶，待上機(jī)分析。

1.5 UPLC-MS/MS測定條件

1.5.1 色譜條件Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm；美國Waters公司)；流動相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))氨水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，40%B；0.5～2.5 min，40%～10%B；2.5～3.5 min，10%B；3.5～3.6 min，10%～40%B；3.6～5.0 min，40%B。流速：0.4 mL/min，柱溫：45 ℃；自動進(jìn)樣器溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件電噴霧(ESI)離子源，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣(高純N2)：溫度為500 ℃，流量為1 000 L/h；錐孔反吹氣(高純N2)流量為150 L/h；碰撞氣為高純Ar。目標(biāo)物的監(jiān)測離子對(m/z)、錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 孕酮及其同位素的質(zhì)譜分析條件Table 1 Optimized MS/MS parameters for progesterone and progesterone-D9

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

血清樣品常用的前處理方法包括蛋白沉淀、固相萃取(SPE)、LLE萃取等。孕酮的質(zhì)譜檢測文獻(xiàn)中，大多采用正己烷對樣品進(jìn)行LLE萃取[3,15-16]。為有效去除脂質(zhì)干擾，本實(shí)驗(yàn)采用兩步LLE萃取對樣品進(jìn)行凈化，第一步使用乙酸乙酯-正己烷(3∶2)對孕酮進(jìn)行提?。坏诙郊尤胩妓徕c去除樣品中的極性脂質(zhì)物質(zhì)，再用正己烷反復(fù)萃取2次。該凈化步驟有效降低了雜質(zhì)干擾，提高了血清樣品中孕酮的回收率。同時(shí)，由于用甲醇作溶劑，內(nèi)標(biāo)溶液的加入會使血清蛋白局部產(chǎn)生沉淀，為消除沉淀的影響，本實(shí)驗(yàn)在加樣前用氮?dú)鈱⑷軇┐蹈?。以乙酸銨作解離劑能將孕酮與結(jié)合蛋白完全解離，同時(shí)避免了內(nèi)標(biāo)物與蛋白的結(jié)合，消除內(nèi)標(biāo)物與分析物回收率的不完全平衡，從而使分析物的回收率趨于一致，提高檢測的精密度。優(yōu)化后的處理方法，可使樣品的絕對回收率達(dá)到80%。

2.2 流動相的選擇

首先考察了甲醇和乙腈作為流動相時(shí)的分離效果和響應(yīng)信號，結(jié)果顯示采用乙腈為流動相時(shí)，孕酮和孕酮-D9的峰形較差，保留時(shí)間靠前；甲醇為流動相時(shí)的背景干擾小，孕酮和孕酮-D9均能獲得理想的峰形，且響應(yīng)信號明顯較乙腈作為流動相時(shí)高，這可能是由于甲醇作為流動相時(shí)待測物的離子化效率更高，因此選擇甲醇-水作為流動相。另比較了0.1%氨水溶液和10 mmol/L乙酸銨溶液兩種水相溶液與甲醇組合的流動相體系的分離效果和靈敏度，發(fā)現(xiàn)以0.1%氨水溶液作水相時(shí)，孕酮的響應(yīng)值較高，分離效果和靈敏度較好。因此，流動相確定為0.1%氨水溶液和甲醇。在“1.5”條件下，孕酮和同位素標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖見圖1。

圖1 孕酮及同位素標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of progesterone and progesterone-D9 standards

2.3 方法學(xué)評價(jià)

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指樣品中的背景雜質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)譜信號的影響(增強(qiáng)或抑制)，通常通過比較目標(biāo)物在基質(zhì)和空白溶劑中的響應(yīng)信號進(jìn)行評價(jià)[16]。用空白溶劑(甲醇)分別配制低、中、高質(zhì)量濃度(0.05、0.5、5.0 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液并添加內(nèi)標(biāo)工作溶液，提取制得標(biāo)準(zhǔn)溶液a；取真實(shí)血清樣品，分別添加低、中、高質(zhì)量濃度水平的孕酮標(biāo)準(zhǔn)溶液及10 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液(10 ng/mL)，提取制得基質(zhì)樣品b；取相同的血清樣品添加內(nèi)標(biāo)工作溶液，提取制得基質(zhì)對照樣品c。對樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜測定，參照Botelho方法[18]進(jìn)行計(jì)算，ME%=(Rb-Rc)/Ra×100%，其中R為樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液中孕酮和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)信號的比值。一般認(rèn)為，當(dāng)ME值接近100%時(shí)，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示本方法的ME平均值為95.20%，表明樣品基質(zhì)對孕酮的質(zhì)譜響應(yīng)無明顯影響。

2.3.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，取“1.3”系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各100 μL,加入10 μL孕酮-D9內(nèi)標(biāo)工作溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x,pg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算血清中待測物的濃度。結(jié)果顯示，孕酮在10～10 000 pg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.999 8)，回歸方程為y=1.104x+34.013；系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積穩(wěn)定，RSD為7.9%。按信噪比(S/N)為3的質(zhì)量濃度確定檢出限(LOD)為5 pg/mL，S/N為10的質(zhì)量濃度確定定量下限(LOQ)為10 pg/mL。

2.3.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取10 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液于1.5 mL離心管中，加入0.1 mL空白血清基質(zhì)，分別配制低、中、高3種質(zhì)量濃度(0.05、0.5、5.0 ng/mL)的質(zhì)量控制(QC)樣品。每個(gè)濃度平行制備6份，按照本方法進(jìn)行提取與測定，并計(jì)算平均回收率和日內(nèi)RSD;連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間 RSD。結(jié)果表明，孕酮的平均回收率為91.5%～106%，日內(nèi)RSD和日間RSD均在10%以內(nèi)(表2)，符合生物樣品分析要求。

表2 血清中孕酮的回收率及精密度Table 2 Recoveries and precisions of progesterone in serum

2.3.4 樣品穩(wěn)定性制備低、中、高3種質(zhì)量濃度水平(0.378、4.510、5.872 ng/mL)的血清樣品，分別考察了其在室溫下放置4 h、樣品提取后提取物于4 ℃儲存24 h、3個(gè)凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性。以6次測定的平均值為樣品實(shí)際濃度，結(jié)果顯示孕酮的響應(yīng)值變化低于15%，表明樣品在以上3種條件下均可穩(wěn)定儲存。

2.4 臨床血清樣品的檢測

采用本文建立的分析方法，對采集的30例真實(shí)血清樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，所有樣品均檢出孕酮，質(zhì)量濃度為0.050 2～1.363 5 ng/mL，均在正常生理范圍內(nèi)，表明所測血清樣品的來源個(gè)體生理表現(xiàn)健康。

3 結(jié) 論

本文建立了檢測人血清中孕酮的UPLC-MS/MS法，對于基質(zhì)極其復(fù)雜的血清樣品采用兩步液液萃取法，增加了提取效率，極大提高了方法靈敏度。該方法無需衍生化，樣品制備簡單；且以同位素為內(nèi)標(biāo)，提高了方法準(zhǔn)確度，具有較高的實(shí)用性，可用于臨床血清樣品檢測。