再生紙與原紙中礦物油成分的LC-GC-MS檢測(cè)及鑒別

朱麗嫻，林勤保*，陳 勝，鐘懷寧，李 忠，廖 佳

(1.暨南大學(xué) 包裝工程研究所，廣東 珠海 519070；2.廣州海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品接觸材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623；3.拱北海關(guān)技術(shù)中心化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519015)

廢紙回收過(guò)程中無(wú)法完全清除紙張中所有的污染物(重金屬、印刷油墨等)，因此是否將再生紙用作食品包裝材料一直存在爭(zhēng)議。美國(guó)食品和藥品管理局規(guī)定滿足一定安全條件的再生纖維可用作食品接觸材料[1]；在歐洲，食品接觸用紙和紙板材料(包括再生纖維制成的紙)必須符合歐盟各成員國(guó)的相應(yīng)法規(guī)[2-3]。這些國(guó)家和地區(qū)建立了限制食品接觸用紙(包括再生紙)中多種有害物質(zhì)含量的法規(guī)[1-4]，此外，我國(guó)也建立了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)以評(píng)估食品接觸用紙的安全性[5]。但再生紙中可能還存在其它未知有害物質(zhì)，這些物質(zhì)目前尚無(wú)規(guī)定或無(wú)法檢測(cè)。此外，由于紙張的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，潛在的遷移物會(huì)吸附在纖維素纖維上，甚至可能通過(guò)頂空或直接接觸的方式釋放到食品中[6]。

科學(xué)研究表明，再生紙食品接觸材料(盒子、紙袋)含有的一系列污染物可能遷移到食品中，例如重金屬(鎘、汞和鉛)、增塑劑和礦物油[7-9]，其中，再生紙中礦物油的研究頗受關(guān)注。學(xué)者Biedermann等[10]的研究表明，再生紙食品接觸材料是食品受礦物油污染的潛在來(lái)源之一；然而其另一項(xiàng)研究使當(dāng)局陷入了兩難境地：廢紙回收是為了材料的可持續(xù)利用，但根據(jù)毒理學(xué)評(píng)估，再生紙中有害物質(zhì)的遷移通常是不可接受的[11]。

此外，不少學(xué)者研究了再生紙和原紙的鑒別方法。Asensio等[12]分析了再生紙和原紙中的揮發(fā)性化合物殘留，并對(duì)兩者進(jìn)行分類。Xin等[13]通過(guò)傅里葉變換近紅外光譜(FTIR)結(jié)合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，對(duì)僅由原生纖維制成的薄紙和含再生、原生兩種纖維制成的薄紙進(jìn)行分類，該方法無(wú)損且省時(shí)，但并未研究造成原生纖維和再生纖維之間差異的化學(xué)成分。Song等[14]利用氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合主成分分析成功鑒別了原生和再生聚苯乙烯發(fā)泡餐盒，且篩選出差異性物質(zhì)。

本研究基于PCA、正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)，使用在線液相色譜-氣相色譜-質(zhì)譜(LC-GC-MS)檢測(cè)再生紙和原紙的礦物油(MOH)成分，分析再生紙和原紙中飽和烴礦物油(MOSH)和芳香烴礦物油(MOAH)餾分之間的差異，并鑒別出可作為再生紙化學(xué)標(biāo)記物的成分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

50種紙樣品(24種再生紙、26種原紙)來(lái)源于不同的紙張供應(yīng)商和生產(chǎn)商(廣東、上海等)，紙樣相關(guān)信息(克重、厚度、再生漿比例、類型)列于表1。

MOSH餾分內(nèi)標(biāo)：十二烷(CAS號(hào)112-40-3)、十四烷(CAS號(hào)629-59-4)、十六烷(CAS號(hào)544-76-3)、二十烷(CAS號(hào)112-95-8)、二十四烷(CAS號(hào)646-31-1) 、三十五烷(CAS號(hào)630-07-9)、四十烷(CAS號(hào)4181-95-7)、5-α-膽甾烷(CAS號(hào)481-21-0)；MOAH餾分內(nèi)標(biāo)：正己基苯(CAS號(hào)1077-16-3)、1,3,5-三叔丁基苯(CAS號(hào)1460-02-2)、聯(lián)苯(CAS號(hào)92-52-4)、正壬基苯(CAS號(hào)1081-77-2)、苝(CAS號(hào)198-55-0)；上述試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。二氯甲烷和正己烷(色譜純，德國(guó)Merck公司)，乙醇(HPLC級(jí)，荷蘭Biosolve公司)。

(續(xù)表1)

R1-R24 are recycled samples,V1-V26 are virgin samples

1.2 儀器與設(shè)備

振動(dòng)篩(SM-30 CONTROL，德國(guó)EdmündBuhler GmbH)；離心機(jī)(4-15，德國(guó)Sigma公司)；LC-GC-Q-Orbitrap-MS系統(tǒng)(德國(guó)Thermo Scientific公司)，包括TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器、Phoenix 9000 液相色譜、UVIS 20UV微型紫外檢測(cè)器、帶預(yù)備柱進(jìn)樣器的TRACE 1310 氣相色譜、轉(zhuǎn)移開關(guān)閥門、電子電離(EI)源和Orbitrap MS。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紙樣中礦物油的提取參考前人研究方法[15]，稱取1.000 g紙樣于40 mL的帶蓋玻璃小瓶中，加入20 mL萃取溶液(乙醇-正己烷，體積比1∶1)和50 μL內(nèi)標(biāo)液(質(zhì)量濃度：5-α-膽甾烷和苝為500 mg/L，其它MOSH內(nèi)標(biāo)為300 mg/L，其它MOAH內(nèi)標(biāo)為100 mg/L，溶劑為正己烷)；將混合物在振動(dòng)篩上以190 r/min振動(dòng)2 h后，加入20 mL超純水，并以2 000 r/min離心2 min，取出有機(jī)相(上層液體)于進(jìn)樣小瓶中，待上機(jī)。每5個(gè)紙樣進(jìn)樣前，對(duì)試劑空白進(jìn)行分析，以識(shí)別設(shè)備或使用材料中的系統(tǒng)或非系統(tǒng)污染。

1.3.2 LC-GC-Q-Orbitrap-MS分析在線LC分析：流動(dòng)相A為正己烷，B為二氯甲烷；色譜柱為L(zhǎng)iChrospher 60 SI柱(250 mm× 2.0 mm，5 μm，德國(guó)Merck公司)。除另有說(shuō)明外，流動(dòng)相流速為300 μL/min。梯度洗脫：初始為0%B，0.5 min內(nèi)升為30%B，保持至3.5 min；在1 min內(nèi)升為40%B，保持至6.3 min;在6.4 min時(shí)將流動(dòng)相換成100%B(流速增至500 μL/min)，保持至15 min；15.1 min起，流動(dòng)相改為0%B，保持至35 min(15.1～25 min流速為500 μL/min)[16]，此設(shè)置用于重新平衡，并與GC-Q-Orbitrap-MS分析配合使用。進(jìn)樣量為50 μL。

轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：通過(guò)保留間隙技術(shù)進(jìn)行LC-GC轉(zhuǎn)移[17]，LC分離中，MOSH餾分在保留時(shí)間2.0～3.5 min洗脫，而MOAH餾分在保留時(shí)間4.0～5.5 min洗脫[17]，本實(shí)驗(yàn)中MOSH和MOAH餾分的轉(zhuǎn)移時(shí)間(LC至GC-MS)分別為2.0～3.5 min和4.0～6.5 min。每個(gè)樣品需進(jìn)樣2次，以分別獲得MOSH和MOAH餾分的原始數(shù)據(jù)(包括總離子流色譜圖)。LC系統(tǒng)用于分離MOSH和MOAH餾分，當(dāng)MOSH餾分中不存在芳香烴，MOAH餾分中不存在脂肪烴，說(shuō)明分離成功。

GC分析：ZB5-MS氣相色譜柱(15 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)Phenomenex公司)，柱箱溫度為60 ℃(保持10 min)，以20 ℃/min升至350 ℃，保持8 min。載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min。

MS分析：使用Tune 2.7和Xcalibur 4.1軟件(德國(guó)Thermo Scientific)控制該儀器。EI源(70 eV)，離子源溫度為250 ℃，全掃描模式，質(zhì)量范圍為m/z50～650。溶劑延遲至9 min。在每批進(jìn)樣序列之前，以全氟三丁胺作為校正氣體進(jìn)行調(diào)諧、質(zhì)量校正和泄漏評(píng)估。

1.3.3 譜圖收集與數(shù)據(jù)預(yù)處理利用Xcalibur 4.1和TraceFinder 4.0軟件(德國(guó)Thermo Scientific)對(duì)色譜圖進(jìn)行處理。通過(guò)譜圖解卷積和NIST譜庫(kù)(NIST 2014/EPA/NIH)進(jìn)行化合物篩選鑒定。將LC-GC-Q-Orbitrap-MS原始數(shù)據(jù)文件(各樣品的MOSH和MOAH餾分文件)導(dǎo)入TraceFinder，并進(jìn)行峰檢測(cè)、解卷積和保留時(shí)間對(duì)準(zhǔn)。解卷積參數(shù)參照文獻(xiàn)[18-19]，使用“所有離子”選項(xiàng)和名為“保留時(shí)間對(duì)齊”的參數(shù)(值為10 s)執(zhí)行色譜峰解卷積，質(zhì)量提取窗口精確至5 ppm，信噪比(S/N)閾值為10，最小強(qiáng)度信號(hào)為2×106，離子重疊窗口為98%。

在TraceFinder中進(jìn)行未知物篩選后，導(dǎo)出樣品的保留時(shí)間、峰面積、未知物表格。由于太多的值可能對(duì)數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生影響，因此缺少值估計(jì)至關(guān)重要。使用“替換為一個(gè)小值(原始數(shù)據(jù)中最小正值的一半)”選項(xiàng)來(lái)估計(jì)缺失值。采用對(duì)數(shù)變換使得數(shù)據(jù)更具可比性[20]。使用Pareto方法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行縮放，即每個(gè)變量的響應(yīng)均以其中心值減去平均值，然后除以其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根，對(duì)經(jīng)上述處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 多元統(tǒng)計(jì)分析SIMCA 14.1(Umetrics，瑞典)用于多變量統(tǒng)計(jì)分析。PCA是一種常見的探索性數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)原始數(shù)據(jù)中的變量進(jìn)行線性擬合，生成互不相關(guān)的新變量，即主成分，這些主成分可以反映原始變量的絕大部分信息。主成分得分圖中樣品的分布情況可以顯示樣品間的相似性，而載荷圖顯示每個(gè)原始變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)[6]。

PLS-DA是一種結(jié)合偏最小二乘回歸模型和判別分析的方法，可同時(shí)分解自變量矩陣X和分類變量Y，并找出自變量X和變量Y間的線性關(guān)系。OPLS-DA是將正交信號(hào)矯正方法與偏最小二乘法相互結(jié)合的判別方法，可過(guò)濾自變量矩陣(X)與變量矩陣(Y)無(wú)關(guān)的信息(即隨機(jī)噪聲)，因此OPLS-DA建立的分類模型可以更好地找出不同樣品組間的差異[21]。

變量權(quán)重值(VIP)用于衡量變量差異對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，根據(jù)VIP值可篩查再生紙和原紙的差異性物質(zhì)。本研究的OPLS-DA模型中，選擇VIP值大于1的變量，并對(duì)選取變量對(duì)應(yīng)的峰面積進(jìn)行t檢驗(yàn)，僅選擇VIP> 1且P<0.05的變量作為潛在標(biāo)記化合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 紙樣的MOSH與MOAH餾分中多種化合物的分析

采用LC-GC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)分析紙樣中MOSH和MOAH組分中的化合物，使用解卷積、NIST庫(kù)進(jìn)行化合物定性。其中，原紙和再生紙中MOAH部分的總離子流圖見圖1，MOAH餾分檢測(cè)的物質(zhì)列于表2，包括單體(即萘、2-甲基萘)和異構(gòu)體(即二甲基萘同分異構(gòu)體、三甲基萘同分異構(gòu)體等)。二異丙基萘同分異構(gòu)體是無(wú)碳復(fù)寫紙的一種染料溶劑，主要存在于回收紙漿中[12]。噻吩化合物可能來(lái)源于麻袋中的少量精煉油，在大米樣品中也可檢測(cè)到噻吩化合物，研究表明二甲基二苯并噻吩和甲基二苯并噻吩可作為礦物油污染的標(biāo)志物[16,22-23]。另外，化合物2,2′-5,5′-四甲基-1,1′-聯(lián)苯和二甲基萘同分異構(gòu)體作為污染物[24]在本文亦被檢出。芳香族化合物(即二甲基萘)可能來(lái)自印刷油墨的染料或溶劑殘留物，或者來(lái)自回收纖維的污染物(MOH殘留物，降解產(chǎn)物和燃燒過(guò)程，煤焦油的成分)。

MOSH餾分中檢測(cè)出具有不同分子量的飽和烴(N-烷烴)。一些正構(gòu)烷烴可能來(lái)源于石蠟，通常作為涂層材料[25]。值得關(guān)注的是，再生紙中均含有高濃度的高分子量飽和烷烴(C25～C33)?？赡苁怯捎诘V物油污染，或是再生樣品中含有聚烯烴組分殘留物[24]。

圖1 原紙(A)和再生紙(B)中MOAH部分的總離子流圖Fig.1 Representative total ion chromatograms of MOAH fraction in virgin(A) and recycled(B) papers

表2 紙樣中MOAH餾分檢出的化合物Table 2 Compounds detected in MOAH fraction of paper samples

there is no exact VIP value for alkylated benzenes and dialkylated benzenes

2.2 再生紙與原紙的多元統(tǒng)計(jì)分析鑒別

應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)方法研究再生紙和原紙之間的差異性，圖2A和2B顯示了再生紙和原紙樣品中MOSH和MOAH餾分的PCA得分圖。

圖2 再生紙和原紙樣品中MOSH餾分(A)與MOAH餾分(B)的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of MOSH fraction(A) and MOAH fraction(B) in recycled and virgin paper samplesR：recycled paper；V：virgin paper

結(jié)果顯示，再生紙和原紙的聚類未明顯分開，導(dǎo)致某些原紙樣品與再生紙聚類。圖2A中，原紙樣品V10、V11與再生紙聚集，可能是由于飽和烴(C25～C33)的污染或在造紙過(guò)程中添加或產(chǎn)生這些化合物，因?yàn)闃悠稸10和V11中的飽和烴(C25～C33)含量高于其它原紙(P<0.05)。圖2A和2B中，大部分再生紙樣品形成一個(gè)集簇，而再生紙樣品R11和R13有向原紙聚集的趨勢(shì)(圖2B)，這是由于R11和R13兩個(gè)樣品中的再生漿比例小于其它再生紙樣品(表1)。因此，再生紙與原紙的分類受樣品中再生漿比例和再生漿來(lái)源的影響，不同來(lái)源、不同比例的再生漿可能會(huì)導(dǎo)致重要成分種類、含量的不同，從而影響PCA得分圖中紙樣的聚集情況。使用PCA模型未能很好地區(qū)分再生紙和原紙，可能是因?yàn)樵偕鷿{不同或次要變量成分的干擾。因此，對(duì)模型進(jìn)行了優(yōu)化，選擇再生紙和原紙樣品(V10、V11異常值除外)MOSH餾分的色譜數(shù)據(jù)建立OPLS-DA模型，以及所有再生紙和原紙樣品MOAH餾分的色譜數(shù)據(jù)建立OPLS-DA模型。

PCA是一種無(wú)監(jiān)督模型，在進(jìn)行主成分分析過(guò)程中考慮了所有變量，而監(jiān)督模型OPLS-DA可以提取變量信息，最大程度地提高群體之間的差異，并有助于識(shí)別潛在的差異性物質(zhì)。使用OPLS-DA模型可以區(qū)分再生紙和原紙(圖3A和圖3B)。兩種模型的R2Y(cum)和Q2(cum)值分別為0.990和0.924(圖3A)，0.968和0.838(圖3B)，表明OPLS-DA模型具有良好的適用性和可預(yù)測(cè)性。通過(guò)置換檢驗(yàn)(Permutation test，n=200)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。置換檢驗(yàn)用于評(píng)估模型是否存在偽造的風(fēng)險(xiǎn)：驗(yàn)證思想是將Y觀測(cè)值的順序隨機(jī)排列而X矩陣保持不變，以比較原始模型與實(shí)際模型的擬合優(yōu)度，將隨機(jī)化產(chǎn)生的R2、Q2值與原始積累的R2、Q2值比較。200次置換實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：R2=(0.0，0.805)，Q2=(0.0，-0.663)(圖3A)；R2=(0.0，0.77)，Q2=(0.0，-0.527)(圖3B)。表明OPLS-DA模型具有較好的可靠性，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

圖3 再生紙和原紙樣品中MOSH餾分(A)與MOAH餾分(B)的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of MOSH fraction(A) and MOAH fraction(B) in recycled and virgin paper samplesR：recycled paper；V：virgin paper

2.3 原紙與再生紙的差異性物質(zhì)

基于差異性化合物的選擇標(biāo)準(zhǔn)，VIP>1且P<0.05，可確定的差異性化合物為：MOAH餾分的二異丙基萘同分異構(gòu)體、四甲基聯(lián)苯同分異構(gòu)體、二甲基聯(lián)苯同分異構(gòu)體、異丙基聯(lián)苯同分異構(gòu)體，以及MOSH餾分的正構(gòu)烷烴(C25～C33)；表2中保留時(shí)間18.63 min和18.71 min對(duì)應(yīng)的兩個(gè)峰未能定性。再生紙中這些物質(zhì)的含量高，而在原紙中濃度低或未檢出，因此這些化合物具有區(qū)分原紙和再生紙的潛力。

2.4 基于再生紙和原紙差異性物質(zhì)的多變量分析

為評(píng)估所選差異性標(biāo)記物的判別能力，分別基于所選化合物的PCA和OPLS-DA模型對(duì)再生紙和原紙的MOSH和MOAH餾分進(jìn)行鑒別分析。圖4A為基于差異性物質(zhì)的再生紙和原紙MOSH餾分的PCA得分圖，再生紙和原紙實(shí)現(xiàn)了良好分離，前兩個(gè)主成分共解釋了95.8%的變量。圖4B為再生紙和原紙MOAH餾分的PCA得分圖，前兩個(gè)主成分解釋了90.1%的變量，再生紙和原紙之間的分離效果優(yōu)于圖2B。但圖4B中再生紙樣品R1、R5、R7、R9、R11和R13傾向于與原紙聚集，主要?dú)w因于這幾種再生紙的回收紙漿來(lái)源和比例，檢測(cè)結(jié)果表明這幾種樣品中差異性物質(zhì)(二異丙基萘同分異構(gòu)體、四甲基聯(lián)苯同分異構(gòu)體、二甲基聯(lián)苯同分異構(gòu)體、異丙基聯(lián)苯同分異構(gòu)體)的含量低于其它再生紙樣品。相比之下，再生紙和原紙中MOSH餾分的差異性物質(zhì)具有更好的區(qū)分效果。

圖4 基于差異性物質(zhì)的再生紙(R)和原紙樣品(V)的PCA得分圖Fig.4 PCA score plots of recycled(R) and virgin(V) paper samples based on differential substancesA：MOSH；B：MOAH

圖5 基于MOH中差異性物質(zhì)的再生紙和原紙樣品的PCA得分圖Fig.5 PCA score plots of recycled and virgin paper samples based on MOH differential substancesR：recycled paper；V：virgin paper

使用所選差異性化合物建立OPLS-DA模型，兩種模型的R2Y(cum)和Q2(cum)分別為0.916和0.913(MOSH餾分)，0.937和0.913(MOAH餾分)。為驗(yàn)證模型，進(jìn)行了置換實(shí)驗(yàn)(n=200)，得R2=(0.0，-0.076 9)，Q2=(0.0，-0.145)(MOSH餾分)；R2=(0.0，0.064)，Q2=(0.0,-0.297)(MOAH餾分)，表明OPLS-DA模型具有良好的適應(yīng)性和可預(yù)測(cè)性。

綜合考慮MOSH和MOAH餾分中的差異性物質(zhì)，建立PCA模型，如圖5(不包括V10和V11)。結(jié)果顯示，再生紙和原紙具有更明顯的區(qū)分效果；再生紙樣品R1、R5、R7、R9、R11和R13與原紙樣品不再聚集，這6個(gè)樣品聚為一小類。表明這些樣品的再生紙漿在MOAH餾分中的差異性化合物(如二異丙基萘同分異構(gòu)體)含量較低，但MOSH餾分中有足夠的正構(gòu)烷烴(C25～C33)可將它們與原生紙區(qū)分開。

3 結(jié) 論

本研究利用LC-GC-MS分析了再生紙和原紙中的礦物油成分，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)再生紙和原紙進(jìn)行鑒定。由于回收過(guò)程中廢紙的污染并不能完全清除，再生紙中含有較多的飽和烴礦物油與芳香烴礦物油。篩選出再生紙和原紙的差異性物質(zhì)有：MOAH餾分中的二異丙基萘同分異構(gòu)體、四甲基聯(lián)苯同分異構(gòu)體、二甲基聯(lián)苯同分異構(gòu)體、異丙基聯(lián)苯同分異構(gòu)體，以及MOSH餾分中正構(gòu)烷烴(C25～C33)?；谠偕埡驮堉蠱OH的差異性物質(zhì)建立的PCA模型能夠很好地區(qū)分再生紙和原紙。

致謝：感謝瑞士蘇黎世SQTS提供設(shè)備儀器的使用便利，以及Thomas Gude博士對(duì)本論文的幫助。感謝暨南大學(xué)研究生短期出國(guó)交流計(jì)劃的資助。