長江中下游環(huán)境DNA宏條形碼生物多樣性檢測技術初步研究

徐 念, 熊美華, 邵 科, 闕延福, 李鍵庸

水利部中國科學院水工程生態(tài)研究所， 水利部水工程生態(tài)效應與生態(tài)修復重點實驗室&湖北省水生態(tài)保護與修復工程技術研究中心， 湖北 武漢 430079

淡水生態(tài)系統(tǒng)為人類文明發(fā)展提供了重要資源，然而面臨著比陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)更嚴重的威脅[1-2]，是全球生物多樣性喪失最嚴重的區(qū)域之一，卻缺乏足夠的調(diào)查研究[3-5]. 物種是生物多樣性的核心組成部分，對物種資源的調(diào)查和監(jiān)測是生物多樣性保護的重要基礎[6-7]，在全球生物多樣性喪失日益嚴重的背景下，對生物多樣性現(xiàn)狀全面了解的需求尤為緊迫[8].

長江是我國淡水資源的寶庫，但多年來受人類活動影響，長江生物多樣性持續(xù)下降，水生態(tài)保護形勢嚴峻. 2018年4月，生態(tài)環(huán)境部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和水利部聯(lián)合發(fā)布了《重點流域水生生物多樣性保護方案》，明確提出開展長江等重點流域水生生物多樣性本底調(diào)查的主要目標，以及在流域干流等水域開展魚類及水生哺乳動物等物種的組成、分布和種群數(shù)量進行調(diào)查觀測的重點任務. 同年9月，國務院辦公廳發(fā)布了《關于加強長江水生生物保護工作的意見》，要求到2020年長江流域重點水域?qū)崿F(xiàn)常年禁捕，強調(diào)提升監(jiān)測能力，全面開展水生生物資源與環(huán)境本底調(diào)查，提高監(jiān)測系統(tǒng)自動化智能化，加強大數(shù)據(jù)集成分析. 生物多樣性研究是一項工作量巨大的長期任務，過去零散的調(diào)查數(shù)據(jù)已無法滿足當前的研究和管理需求[7]，需要在流域范圍內(nèi)獲取更全面更系統(tǒng)的資料，因此對調(diào)查方法的科學性和有效性、調(diào)查結果的全面性和準確性，以及對大數(shù)據(jù)的綜合分析能力提出了更高的要求.

環(huán)境DNA宏條形碼(environmental DNA metabarcoding)指從環(huán)境樣本中提取DNA，利用高通量測序分析獲得大量DNA序列，通過序列檢索比對檢測環(huán)境中的多個物種[8]，因其簡單高效、靈敏度高等優(yōu)勢獲得廣泛關注[9]. 環(huán)境DNA宏條形碼對物種及其豐度的檢測在微生物中已形成標準化的流程，如16S和18S擴增子多樣性分析，有力地補充了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺失[10]. 進入21世紀初以來，通過環(huán)境DNA檢測大型生物的技術逐漸興起，水樣環(huán)境DNA被用于魚類和兩棲類的特異性物種檢測[11-12]. Thomsen等[13]于2012年首次報道了利用水樣環(huán)境DNA高通量測序進行人工池塘兩棲類和魚類多物種檢測，此后環(huán)境DNA宏條形碼成為水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性研究的熱點，在海洋、湖泊、河流等生境得到應用[14-16]. 國內(nèi)研究中，單一物種的環(huán)境DNA檢測已針對鰱[17]、中華鱘[18]和長江江豚[19-20]在長江流域得到應用，已有通過水樣環(huán)境DNA克隆測序進行的少數(shù)魚類物種檢測初步研究[21]，水樣環(huán)境DNA宏條形碼研究已在海洋環(huán)境[22]開展，淡水生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境DNA宏條形碼研究在國內(nèi)引發(fā)關注但鮮見報道.

長江中下游具有獨特的江湖生態(tài)系統(tǒng)，分布有多種重要經(jīng)濟魚類[23]，也是瀕危水生動物的重要棲息地[24]，而長江中下游因流量大、泥沙含量高、物種資源衰退等因素對環(huán)境DNA檢測提出了巨大挑戰(zhàn)[20-21]. 該研究在長江中下游3個江段(新灘、安慶和蕪湖)采集水樣，利用通用分子標記建立長江水樣環(huán)境DNA宏條形碼物種檢測體系，分析該方法在長江水生物種種類組成和資源量評估中的有效性，旨在探索高敏感度非入侵式的長江生物多樣性監(jiān)測新方法，以期為長江水生態(tài)監(jiān)測體系建設提供技術支撐.

1 研究方法

1.1 環(huán)境DNA樣本采集

于2016年1月在長江中下游干流新灘、安慶、蕪湖3個江段各設置1個采樣點，每個采樣點用全新2 L可密封廣口瓶(Nikko，日本亞速旺公司)采集3個2 L表層水樣，用0.45 μm聚醚砜濾膜(Pall，美國頗爾公司)真空抽濾，玻璃抽濾漏斗在每次使用前用10%次氯酸鈉消毒液浸泡30 min并充分沖洗干凈. 抽濾完成后，濾膜冷凍保存并盡快送回實驗室. 用強力水樣DNA提取試劑盒(Mobio，美國Mobio實驗室)提取濾膜DNA，DNA溶液于-20 ℃下保存.

1.2 目的基因片段擴增

利用線粒體細胞色素B簡并引物L14912-CYB (5′-TTCCTAGCCATACAYTAYAC-3′; Y=C或T)和H15149-CYB (5′-GGTGGCKCCTCAGAAGGACATTTG KCCYCA-3′; K=G或T, Y=C或T)[25]對環(huán)境DNA樣本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物片段長度在285 bp左右. 該引物的目標位點是在脊椎動物中廣泛存在的保守區(qū)域，用于河流水樣環(huán)境DNA魚類物種克隆測序檢測[21,26]. 總體積50 μL的反應體系包括4 μL的10×PCR Buffer、1 μL的dNTP (10 mmol/L)、1 μL的正向引物(10 pmol/μL)、1 μL的反向引物(10 pmol/μL)、5 μL的DNA模板和36.5 μL的滅菌雙蒸水. 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、50 ℃ 退火1 min、72 ℃延伸1.5 min (45個循環(huán))；72 ℃最后延伸7 min.

1.3 擴增子高通量測序

采用PCR產(chǎn)物進行文庫構建，用Illumina Miseq平臺進行高通量測序(深圳華大基因科技服務有限公司)，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾，濾除低質(zhì)量的讀長序列，得到有效序列. 使用軟件FLASH v1.2.11進行序列拼接，利用重疊關系將雙末端測序得到的成對有效序列組裝成一條拼接序列，去除沒有重疊關系的序列. 利用軟件USEARCH v7.0.1090將拼接好的序列聚類為OTU(operational taxonomic unit，操作分類單元)，獲得OTU代表序列.

1.4 生物信息學數(shù)據(jù)分析

該研究利用美吉生物云生物信息分析云平臺(www.majorbio.com)對測序序列進行生物信息學分析. 首先將OTU代表序列在Genbank的核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行物種注釋，同時利用序列相似性在線檢索工具BLAST進行人工校核，除去兩端引物序列，核心目標片段100%匹配則被認定為該物種DNA. 然后利用分析平臺的生物多樣性云分析流程v3.0進行交互分析，對注釋OTU進行篩選，統(tǒng)計不同分類水平的物種數(shù)量、OTU數(shù)量、序列數(shù)量，計算物種序列相對豐度.

2 結果與討論

2.1 水樣環(huán)境DNA物種注釋

2.1.1種類組成

長江中下游干流新灘、安慶、蕪湖3個江段水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測共得到有效拼接序列 334 623 條，平均序列長度為285 bp，聚類得到425個OTU，其中在數(shù)據(jù)庫中達到匹配的OTU為54個(總序列數(shù) 162 398)，共注釋10目13科32種(見表1)，其中魚類20種、水生哺乳動物1種、鳥類4種、陸生哺乳動物7種. 魚類包括鯉形目、鲇形目、鱸形目和鯡形目物種，其中鯉形目物種數(shù)最多(見圖1)；水生哺乳動物為國家一級保護動物長江江豚，是長江中唯一現(xiàn)存的水生哺乳動物，也是目前中國唯一的淡水豚類；鳥類包括家禽和野生物種；陸生哺乳動物包括偶蹄目牲畜、褐家鼠和人.

所有注釋物種中，水生物種數(shù)占65.6%，其他為陸生動物. 以無脊椎動物為主要對象的環(huán)境DNA宏條形碼研究報道了河流水樣環(huán)境DNA包含水生和陸生生物群落的多樣性信息[27]. 該研究以脊椎動物為主要對象，結果表明，長江水樣環(huán)境DNA包含水生和陸生物種信息，通過環(huán)境DNA宏條形碼可檢測多類群物種. 該研究采樣點位于人口密集的城鎮(zhèn)江段，水樣中檢測到的陸生物種大多與人類生產(chǎn)生活息息相關，水樣環(huán)境DNA物種組成體現(xiàn)出人類活動與河流生態(tài)系統(tǒng)的密切聯(lián)系.

2.1.2序列相對豐度

在所有注釋物種中，魚類序列數(shù)占總序列數(shù)的78.5%，其中鯉形目序列數(shù)占魚類總序列的96.2%，鯡形目占3.5%，鲇形目占0.2%，鱸形目占0.1%，各類目序列數(shù)見表2. 在20種魚類物種中，序列數(shù)排序前5位的依次為鰱、團頭魴、青魚、短頜鱭和草魚，各物種序列數(shù)在魚類中占比依次分別為52.5%、23.7%、17.0%、3.5%和1.3%. 水生哺乳動物長江江豚的序列數(shù)在所有注釋水生物種中占比約為 1/4 000. 陸生物種中，序列相對豐度最高的是雞，其序列數(shù)占陸生物種總序列數(shù)的96.0%，其次為人(占比為2.6%)、鴻雁(占比為0.8%)、牛(占比為0.6%)和綿羊(占比為0.2%). 綜合種類數(shù)量和序列相對豐度，長江中下游水樣環(huán)境DNA主要包含水生物種信息，魚類是水生脊椎動物的主要類群，其中鯉形目占絕大多數(shù).

序列相對豐度受物種豐度的影響，在一定程度上序列相對豐度體現(xiàn)了物種在環(huán)境中可能具有的豐度相互關系[28]，但二者的相關性不太確定[13,29]. 從環(huán)境中物種DNA的釋放、運輸和降解，到環(huán)境樣本的采集、目的片段的擴增和測序，檢測結果中序列相對豐度受多種因素的影響，如環(huán)境DNA的來源、濃度分布、引物的擴增偏向性等[30]. 環(huán)境樣本中特定物種的環(huán)境DNA檢測濃度也不一定與其物種豐度具有顯著相關關系[31]. 盡管在多變的自然環(huán)境中相關性較弱，物種環(huán)境DNA濃度依然體現(xiàn)了物種豐度的實質(zhì)性變化，利用環(huán)境DNA宏條形碼準確評估物種數(shù)量或生物量則需要對采樣策略和檢測分析技術提出更高的要求[15,32].

表1 長江中下游3個江段水樣環(huán)境DNA宏條形碼注釋物種

注： +表示采樣點水樣中檢測到物種環(huán)境DNA.

2.2 樣本聚類分析

在OTU水平基于Bray-curtis距離算法的樣本進行層級聚類(hierarchical clustering)，根據(jù)不同的距離閾值可將樣本劃分為聚類小組，結果如圖2所示. 由圖2可見，同一采樣點的樣本首先聚類在一起，然后安慶采樣點和蕪湖采樣點的樣本聚類為一支，新灘采樣點樣本則單獨聚類為一支. 相似性分析結果顯示，新灘、安慶、蕪湖3個采樣點組間差異顯著大于其組內(nèi)差異(見圖3)(P=0.001)，置換多因素方差分析結果表明，分組對樣本差異具有可信的解釋度(R2=0.924 6，P=0.005). 綜上，同一采樣點樣本差異度較小，表明在一定范圍內(nèi)環(huán)境DNA的分布與組成具有穩(wěn)定性，而在河流中不同采樣點間的顯著差異可以為空間差異性研究提供基礎. 河道間距較近的安慶和蕪湖采樣點聚類距離也較近，推測河流水樣環(huán)境DNA的組成相似性可能與采樣點間的距離有關. 不同江段物種組成的差異性會導致水樣中環(huán)境DNA的組成差異，但在該研究中檢測結果不排除其他因素的影響，環(huán)境DNA組成在河流中的空間差異性還需更多研究數(shù)據(jù)來證實.

圖1 長江中下游水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測種類組成Fig.1 The number of species detected from water samples in the middle and lower reaches of the Yangtze River using environmental DNA metabarcoding

表2 長江中下游水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測物種注釋序列數(shù)Table 2 The number of sequences for each order identified by environmental DNA metabarcoding of water samples in the middle and lower reaches of the Yangtze River

序號物種分類序列數(shù)序號物種分類序列數(shù)1鯉形目122 6326雁形目2792雞形目33 2267鲇形目2763鯡形目4 4468鱸形目1694靈長目9239嚙齒目415偶蹄目37410鯨目32

注： 1、2、3表示采樣點樣本序號. 下同.

圖2 基于OTU水平的樣本層級聚類樹
Fig.2 Hierarchical clustering tree on OTU level

圖3 基于OTU水平的組間距離盒型圖Fig.3 Distance box plot on OTU level of each sample groups

2.3 水生物種分布和資源量

2.3.1魚類

該研究通過水樣環(huán)境DNA檢測到的20種魚類均為在長江中下游傳統(tǒng)魚類資源調(diào)查中出現(xiàn)過的物種[33-35]，包括構成重要漁業(yè)資源的經(jīng)濟魚類草魚、青魚、鰱、鳙、鯉、鯽等. 環(huán)境DNA檢測到的4個類目是長江中下游漁獲物中的主要類目，在所有20種魚類中，鯉形目種類數(shù)占總種類總數(shù)的60%，鲇形目占25%，鱸形目占10%，鯡形目占5%. 長江魚類資源的特點是鯉科魚類種類多[23,36]，該次環(huán)境DNA檢測結果也顯示，鯉科種類占多數(shù). 在已報道的長江中下游干流漁獲物調(diào)查中，鯉科種類占52%～61%[33-35,37]，該次環(huán)境DNA檢測鯉科種類占魚類種類總數(shù)的50%～60%. 在上述漁獲物調(diào)查中，鲇形目、鱸形目和鯡形目分別占11%～22%、12%～19%和3%～6%，該次環(huán)境DNA檢測結果顯示，其分別占18%～23%、0～12%和0～6%. 水利部中國科學院水工程生態(tài)研究所于2017年3月在蕪湖江段開展了6 d漁獲物調(diào)查，記錄每日漁民單船漁獲物種類，各類目魚類種類數(shù)從多到少依次為鯉形目、鲇形目、鱸形目和鯡形目. 圖4顯示了安慶和蕪湖兩江段的漁獲物調(diào)查結果和該次環(huán)境DNA調(diào)查結果的各類目種類數(shù)量占比，從魚類種類組成來看，環(huán)境DNA檢測結果體現(xiàn)了漁獲物的主要類目，且主要注釋類目的種數(shù)比例與漁獲物組成相似.

注： 采樣次數(shù)=采樣點數(shù)×采樣天數(shù)；漁獲物數(shù)據(jù)來源于文獻[34-35,37]和調(diào)查記錄. eDNA表示環(huán)境DNA.

圖4 長江中下游兩江段漁獲物調(diào)查和環(huán)境DNA宏條形碼檢測中目水平魚類種數(shù)占比
Fig.4 Proportion of fish species of each phylum investigated in traditional survey and environmental DNA metabarcoding

鯉形目魚類不僅在種類數(shù)上占優(yōu)勢，在DNA序列數(shù)上也占據(jù)絕對優(yōu)勢，而鯉形目在長江中下游漁獲物調(diào)查中的尾數(shù)和重量均居首位. 對于鯉形目、鲇形目、鱸形目和鯡形目4個主要類目，安慶江段4個類目資源量總和占漁獲物總量的99%以上[33,37]，蕪湖江段4個類目尾數(shù)總和占漁獲物總量的99%以上[34]. 但環(huán)境DNA序列相對豐度和漁獲物資源量百分比之間存在較大差異，如鯉形目序列在3個江段中均占90%以上，而在漁獲物中鯉形目資源量通常為漁獲物總量的60%～80%. 以安慶江段為例，根據(jù)2003年3月—2010年3月[33]和2015年4—6月[37]的漁獲物調(diào)查結果，發(fā)現(xiàn)鯉形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占漁獲物總量的47%～72%和60%～77%，鲇形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占17%～46%和12%～32%，鱸形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占3%～12%和6%～11%，鯡形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占>1%～6%和>1%～4%. 該研究環(huán)境DNA檢測安慶江段鯉形目序列占魚類總序列的92%，鯡形目占7.7%，鲇形目和鱸形目均不足0.1%，與漁獲物反映的各類目資源量相差較大. 一方面如2.1.2節(jié)所述序列相對豐度和物種資源量之間并不具有穩(wěn)定的對應關系; 另一方面該研究每個江段單次調(diào)查獲取的數(shù)據(jù)有限，不能滿足準確的資源量統(tǒng)計分析需求，但序列相對豐度體現(xiàn)出了其中的優(yōu)勢類群鯉形目魚類.

從調(diào)查取樣數(shù)量來看，對比安慶和蕪湖兩江段的已有報道[33-35,37]，將同一采樣點同一天內(nèi)的采樣記為1次采樣，該研究每個江段僅進行了1次采樣，水樣的采集通常在幾分鐘內(nèi)完成，而漁獲物報道中魚類標本的采集在每個江段采樣次數(shù)(采樣點數(shù)×采樣天數(shù))為20～336次(部分數(shù)據(jù)見圖4)，每個采樣點的總采樣時間(單次采樣時間×采樣次數(shù))最低為10 h，最高達 8 064 h，且多數(shù)調(diào)查在取樣時同時使用多個網(wǎng)具，實際工作量更大. 從單次調(diào)查種類數(shù)量來看，在水利部中國科學院水工程生態(tài)研究所于2017年3月開展的蕪湖江段6 d漁獲物調(diào)查中，每天調(diào)查種類為9～21種，平均單次漁獲物調(diào)查種類數(shù)為15.7種，網(wǎng)具數(shù)量4網(wǎng)，該研究蕪湖江段僅一次環(huán)境DNA調(diào)查種類為17種，平行樣本3個. 總的來說，該次環(huán)境DNA調(diào)查檢測到的魚類種數(shù)為各江段漁獲物種數(shù)的31%～49%，而采樣時間不足努力量最少漁獲物調(diào)查的1%，是努力量最多漁獲物調(diào)查的十萬分之一. 可見，與傳統(tǒng)漁獲物調(diào)查相比，環(huán)境DNA調(diào)查方法在采樣效率方面具有明顯的優(yōu)勢. 對比長江中下游安慶江段4個不同年代的漁獲物調(diào)查報道[33,35,37-38]中出現(xiàn)的物種，環(huán)境DNA調(diào)查安慶江段檢測到17種魚類，其中2種魚類(團頭魴、紅鰭原鲌)未在漁獲物調(diào)查中出現(xiàn)，2種魚類(達氏鲌、寡鱗飄魚)僅在1次漁獲物報道中出現(xiàn)，僅7種魚類在4次漁獲物報道中均有出現(xiàn)，漁獲物調(diào)查時間跨度從短至長依次分別為3個月、12個月、6 a和8 a，而環(huán)境DNA取樣僅用1 d完成，可見長時間漁獲物調(diào)查結果仍然會受到捕撈方式的限制，甚至造成一些常見的經(jīng)濟魚類(如草魚、青魚等)在漁獲物調(diào)查中未采集到[35]，環(huán)境DNA調(diào)查通過簡單的取樣方式，可以對傳統(tǒng)調(diào)查結果進行補充. 在國際同類研究中，利用環(huán)境DNA宏條形碼技術在淡水生態(tài)系統(tǒng)的流水生境中檢測到的魚類種數(shù)分別為8種[39]、12種[40]、16種[41]和19種[42]，這些研究均表明環(huán)境DNA宏條形碼和傳統(tǒng)調(diào)查方法相結合能調(diào)查到更多的魚類物種，且環(huán)境DNA調(diào)查方法比傳統(tǒng)調(diào)查方法效率更高. 對于魚類資源調(diào)查來說，環(huán)境DNA宏條形碼需優(yōu)化采樣方案和檢測體系，如增加采樣點和采樣次數(shù)、使用更高效的分子標記等，以檢測到更多物種，并對其進行資源量評估.

注： 傳統(tǒng)調(diào)查分布密度來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的2017年長江江豚科學考察結果[43].

圖5 長江中下游干流3個采樣點位置和長江江豚環(huán)境DNA序列相對豐度
Fig.5 Location of the three sampling sites in the middle and lower reaches of the Yangtze River mainstream and relative abundance of environmental DNA sequences of Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis

2.3.2長江江豚

安慶采樣點3個樣本，以及新灘采樣點1個樣本，均檢測到長江江豚DNA序列，且安慶采樣點長江江豚DNA序列相對豐度(物種序列數(shù)在總測序序列數(shù)中占比)約是新灘采樣點的36倍，蕪湖采樣點未檢測到江豚DNA序列(見圖5). 針對單一物種的環(huán)境DNA檢測技術對瀕危物種具有高敏感度[13]，其為長江江豚監(jiān)測提供了有力工具[19-20]. 該研究結果顯示，以多物種為對象的水樣環(huán)境DNA宏條形碼對于瀕危物種也具有一定的敏感度.

綜合2006、2012和2017年3次長江江豚考察結果[43-45]，發(fā)現(xiàn)安慶江段長期以來均處于長江干流長江江豚密度最高的江段，而中下游鄂州以上和安慶以下江段則密度較低. 該研究中安慶采樣點位于皖河口下游約2 km處，皖河口是安慶市江豚自然保護區(qū)的重點水域，是長江江豚群體的重要棲息地[35]，安慶采樣點的長江江豚環(huán)境DNA檢出率和DNA序列相對豐度在3個采樣點中都是最高的，與傳統(tǒng)調(diào)查中長江江豚密度最高的江段相一致. 與2017年江豚科學考察結果相比，新灘采樣點處于長江江豚分布密度居中的江段，位于長江新螺段白鱀豚國家級自然保護區(qū)內(nèi)靠近下游邊界，該保護區(qū)也是長江江豚的聚集地；而蕪湖采樣點處于江豚分布密度最低的江段，距離上游銅陵淡水豚國家級自然保護區(qū)下游邊界約60 km[46]. 該次環(huán)境DNA檢測結果表明，長江中下游干流長江江豚環(huán)境DNA檢出率和序列相對豐度與其密度分布相符合，但利用環(huán)境DNA宏條形碼進行長江江豚群體分布和資源量的監(jiān)測還需要針對性的開展進一步研究.

2.4 淡水環(huán)境DNA宏條形碼技術應用

該研究體現(xiàn)了環(huán)境DNA宏條形碼技術在長江水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性研究領域的主要優(yōu)勢，采集水樣將調(diào)查研究過程對目標物種和生態(tài)環(huán)境的影響降到極低，高效的采樣需要較少的人力和時間付出，且宏條形碼分析流程標準化，有利于不同樣本間的比較，結果可體現(xiàn)大尺度區(qū)域群落結構，突出其中的優(yōu)勢類群，對瀕危物種亦具有一定敏感度. 此外，高通量測序可以在同一樣本中快速獲得比克隆測序更多的序列作為物種注釋的基礎，在已報道的長江魚類環(huán)境DNA研究[21]中，通過水樣環(huán)境DNA克隆測序方法在24個采樣點共檢測到10種魚類序列，每個采樣點檢測到1～3種魚類，而該研究通過高通量測序在3個采樣點共檢測到20種魚類，每個采樣點檢測到13～17種魚類，比克隆測序方法效率大幅提高. 隨著高通量測序技術和生物信息學分析方法的快速發(fā)展，環(huán)境DNA宏條形碼將揭示更多水體中所包含的生物多樣性信息. 該研究中環(huán)境DNA宏條形碼方法在物種多樣性檢測方面也存在一定的局限性. 在所有測序得到的OTU中，成功注釋物種的OTU比例低，約有87.3%的OTU無法在數(shù)據(jù)庫中匹配到物種，這些未注釋的OTU包含總測序序列數(shù)量的51.5%，數(shù)據(jù)庫中收錄的DNA序列成為環(huán)境DNA宏條形碼物種注釋的重要限制因素[29]. 環(huán)境DNA宏條形碼技術極大程度上依賴于檢測中所選擇的分子標記，不同的分子標記可以針對不同的目標類群，同時分子標記也可能存在一定的擴增偏向性[30]，該研究檢測到的物種有限，后續(xù)研究可篩選更多通用分子標記，以獲取足夠的序列信息用于生物多樣性研究. 在該研究中各物種序列相對豐度在不同采樣點各不相同，同一采樣點的樣本則相當接近，表明水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測在一定范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性和可重復性. 測序結果中存在某些物種的序列數(shù)量占比極大的現(xiàn)象，如在新灘采樣點，鰱的序列數(shù)占總注釋序列數(shù)的99.8%，而新灘采樣點注釋的物種總數(shù)最少，約為其他2個采樣點的62%，安慶和蕪湖采樣點物種數(shù)量則較為接近，其原因可能是，新灘采樣點水樣中鰱的DNA濃度較高，在有限的測序數(shù)量下相對豐度較低的物種無法檢出. 根據(jù)研究對象設計合理的采樣方案、設置足夠數(shù)量的采樣點有助于獲得更全面準確的檢測結果.

近年來，利用環(huán)境DNA宏條形碼技術針對淡水生態(tài)系統(tǒng)脊椎動物多樣性的研究日益發(fā)展，但其中環(huán)境樣本來源于大型河流的報道較少，尤其是長江中下游干流這種流量巨大的流水生境，對水樣環(huán)境DNA物種檢測來說存在相當?shù)奶魬?zhàn). 河流是生物多樣性信息傳遞的紐帶[47]，水樣中包含的水陸物種信息可以用于景觀尺度的生物多樣性分析，以及人類活動對河流的影響研究. 該研究驗證了在長江水生態(tài)系統(tǒng)中通過水樣環(huán)境DNA宏條形碼技術進行生物多樣性檢測分析的可行性，同時體現(xiàn)了通過對河流環(huán)境DNA檢測進行景觀尺度的水陸復合生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性綜合分析的可能性. 技術方法的發(fā)展和環(huán)保理念的革新是未來生態(tài)保護不可阻擋的趨勢，通過開發(fā)高效分子標記、發(fā)展測序分析技術，未來環(huán)境DNA所包含的物種條形碼還將被進一步挖掘，環(huán)境樣本中展現(xiàn)出的大尺度復合生態(tài)系統(tǒng)的豐富信息將為生物多樣性研究開拓更廣闊的發(fā)展前景.

3 結論

a) 長江中下游干流新灘、安慶和蕪湖3個江段的水樣環(huán)境DNA宏條形碼分析共檢測到32個脊椎動物物種，其中包括20種魚類，1種水生哺乳動物(長江江豚)和11種陸生動物，其中魚類序列數(shù)占總注釋序列數(shù)的78.5%，表明長江水樣環(huán)境DNA主要包含水生物種信息，同時承載了陸生物種信息，通過水樣環(huán)境DNA宏條形碼可檢測不同類群物種.

b) 環(huán)境DNA檢測到的魚類中，鯉形目種類占60%，鲇形目占25%，鱸形目占10%，鯡形目占5%，為長江中下游漁獲物調(diào)查的主要類目，且各類目包含的種類數(shù)量比例與漁獲物調(diào)查結果具有相似性. 在漁獲物中尾數(shù)和質(zhì)量均居首位的鯉形目在環(huán)境DNA調(diào)查中序列數(shù)也最多，但4個類目序列相對豐度與漁獲物種資源量組成差異較大.

c) 環(huán)境DNA調(diào)查用約占傳統(tǒng)漁獲物調(diào)查幾十至幾百分之一的調(diào)查次數(shù)，百分之一至十萬分之一的調(diào)查時間，檢測到了31%～49%的魚類種數(shù)，表明環(huán)境DNA調(diào)查效率更高，且環(huán)境DNA檢測到了在漁獲物調(diào)查中未出現(xiàn)的物種，可以對傳統(tǒng)調(diào)查結果進行補充，將二者結合可獲得更全面的調(diào)查結果.

d) 在新灘和安慶采樣點均檢測到瀕危物種長江江豚環(huán)境DNA，表明環(huán)境DNA宏條形碼對瀕危物種具有一定敏感度. 在中下游長江江豚密度最高的安慶江段，長江江豚環(huán)境DNA檢出率和序列相對豐度在3個采樣點中都是最高的，而位于長江江豚密度最低的中下游下段的蕪湖采樣點，未檢測到長江江豚環(huán)境DNA. 長江江豚環(huán)境DNA檢出率和序列相對豐度可能主要受其分布密度的影響.

e) 長江中下游水樣環(huán)境DNA宏條形碼分析結果體現(xiàn)了調(diào)查區(qū)域的部分群落結構，顯示出了優(yōu)勢類群，注釋物種包含瀕危物種. 環(huán)境DNA宏條形碼在淡水生物多樣性研究中具有高效率和無損傷的優(yōu)勢. 核酸序列數(shù)據(jù)庫和分子標記體系是環(huán)境DNA宏條形碼物種檢測的主要限制因素，進行全面的物種多樣性監(jiān)測和資源量估算需要對采樣方案和分析方法進行科學設計. 通過水樣環(huán)境DNA，可進一步對河流水陸復合生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性信息進行挖掘.