基于電子舌與SPME-GC-MS技術(shù)檢測腐乳風(fēng)味物質(zhì)

樊 艷，李浩麗，郝怡寧

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

腐乳是一種微生物發(fā)酵大豆制品[1]，按其色澤可以分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳和各種花色腐乳，其中紅腐乳因其色澤鮮艷、口感醇厚和氣味愉悅，深受消費(fèi)者喜愛。腐乳的滋味和香氣是衡量其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，對腐乳的風(fēng)味物質(zhì)展開研究，不僅能夠指導(dǎo)其加工工藝的優(yōu)化，還有助于提高產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而提升其被消費(fèi)的接受度。

滋味物質(zhì)大多是水溶性、非揮發(fā)性的化合物[2]，電子舌是近年發(fā)展起來的一種用于分析滋味物質(zhì)的新型檢測手段[3-4]，目前使用電子舌研究腐乳滋味的報(bào)道較少。揮發(fā)性組分研究的前處理方法主要有液液萃取、同時(shí)蒸餾萃取[5-6]、頂空吸附等[7]。固相微萃取（solid-phase microextractio，SPME）是一種無溶劑樣品前處理技術(shù)，操作簡單、用時(shí)短[8]，被廣泛應(yīng)用于風(fēng)味物質(zhì)的研究，但鮮見應(yīng)用于腐乳揮發(fā)性組分研究的報(bào)道。SPME和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯(lián)用在揮發(fā)性物質(zhì)的分析和未知化合物的鑒定方面有非常理想的效果[9]。

本研究以自制霉腐乳和市購腐乳為研究對象，采用電子舌結(jié)合氨基酸自動分析儀比較腐乳樣本的整體滋味和主要呈味物質(zhì)的異同；采用SPME提取揮發(fā)性組分，同時(shí)對萃取頭進(jìn)行比較選擇，利用GC-MS結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI），對樣本中的揮發(fā)性組分進(jìn)行定性和定量以及風(fēng)味物質(zhì)的分析和比較，為霉腐乳的研發(fā)和生產(chǎn)提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種腐乳樣本：2 種為毛豆腐制得的霉豆腐乳，編號為M1（腐乳毛霉菌種），M2（菌種同M1）；2 種為市購紅方腐乳，編號分別為C1（氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.120%）、C2（氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.921%）。

10%三氯乙酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；500 mg/L正構(gòu)烷烴（C7～C40）混合標(biāo)準(zhǔn)品 美國o2si公司；正己烷（色譜純） 德國CNW公司；H型氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品、茚三酮試劑以應(yīng)液 日本和光純藥工業(yè)株式會社；氨基酸分析用緩沖液 日本三菱化學(xué)株式會社；去離子水（色譜級）由美國Millipore純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；GL-6250A磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Avanti J-26XP離心機(jī) 美國貝克曼公司；ASTREE電子舌（包含ASH、CTS、ANS、NMS、SCS、PKS和CPS 7 個(gè)味覺傳感器和1 個(gè)Ag/AgCl參比電極） 法國Alpha M.O.S公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；MPS XT多功能樣品處理平臺 德國Gerstel公司；L-8900型氨基酸分析儀 日本株式會社日立制作所；SPME萃取頭類型見表1，購自美國Supelco公司。

表1 SPME萃取頭類型Table 1 SPME fibers used in this study

1.3 方法

1.3.1 霉腐乳樣品的制作

2 000 g老豆腐，切成4 cm×4 cm×1.5 cm小方塊，上鍋蒸5min后放置涼透。稱取15 g毛霉菌菌粉，加入500 mL水，攪拌均勻，把切好的豆腐塊以1 cm均勻間隔擺放在蒸鍋上，噴灑配制好的菌液，鍋底加水，蓋好蓋子，溫度15～25 ℃，相對濕度不低于50%，1 d開始長毛，發(fā)酵3 d后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。稱取1 000 g毛豆腐，晾干，蘸取40 g的52°白酒，包裹50 g鹽、15 g辣椒粉和1.6 g花椒粉[11]，入瓶，于陰涼處避光密封儲存一周即可食用，存儲后期M1樣品添加食用油封面，M2未用油封面。

1.3.2 腐乳滋味的電子舌檢測

4 個(gè)腐乳樣本，每個(gè)樣本3 組平行，每組平行樣稱5 g（精確到0.01 g），加50 mL水?dāng)嚢璨⒊?0 min，10 000 r/min離心20 min，過濾，濾液倒入電子舌樣品杯中，和洗液（超純水）間隔放在樣品盤上，采集頻率為120 s/次，每個(gè)樣重復(fù)檢測6 次，取后3 次穩(wěn)定的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（傳感器響應(yīng)值會有一定程度波動[12]）。

1.3.3 游離氨基酸的檢測

樣本冷凍干燥后，研磨成粉，稱取0.2 g（精確到0.001 g）于試管中，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，沉淀樣本中多肽和蛋白質(zhì)，搖勻后存于4 ℃環(huán)境中，每隔10 min搖勻1 次，2 h后取出，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋2 倍后，上全自動氨基酸分析儀測試。

1.3.4 腐乳氣味的SPME-GC-MS檢測

SPME條件[13]：精確稱取3 g樣品于20 mL頂空瓶中，MPS保溫箱溫度60 ℃，平衡時(shí)間10 min，萃取時(shí)間30 min，解吸時(shí)間300 s，萃取頭老化溫度260 ℃，老化時(shí)間30 min。

GC條件[13-14]：DB-5 MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；升溫程序：柱溫35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升溫到80 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫到200 ℃，保持20 min。

MS條件：電子電離源；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；采集模式為全掃描（Scan）；質(zhì)量掃描范圍30～450 u。

RI測定：取正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋100 倍，按GC-MS條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，溶劑延遲時(shí)間5 min，樣品中各揮發(fā)性組分的RI根據(jù)式（1）[15]計(jì)算：

式中：tx為待測組分的保留時(shí)間/min；tn為碳原子數(shù)為n的正烷烴（tn＜tx）保留時(shí)間/min；tn+1為碳原子為n+1的正烷烴（tx＜tn+1）保留時(shí)間/min。

定性和定量：匹配度不小于90，按烷烴標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)信息計(jì)算RI[16-17]，并與其他文獻(xiàn)測定的RI進(jìn)行對比確認(rèn)，對樣品的揮發(fā)性組分進(jìn)行定性；采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量，計(jì)算得到各組分的相對含量。選擇揮發(fā)性組分的總峰面積和峰數(shù)量為考察指標(biāo)，比較不同萃取頭對樣品揮發(fā)性組分萃取效果的影響。

1.3.5 PCA和TAV分析

判別指數(shù)（discrimination index，DI）為進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）時(shí)樣品區(qū)分程度的表征值，當(dāng)DI在80%～100%時(shí)說明區(qū)分有效[18]。采用滋味活性值（taste active value，TAV）評價(jià)組分對滋味的貢獻(xiàn)度，TAV以映了各呈味化合物對樣品滋味的貢獻(xiàn)程度，在評價(jià)單個(gè)組分對整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)時(shí)，TAV是最經(jīng)典、客觀的方法[19]，其值按式（2）計(jì)算[20]。當(dāng)TAV＜1時(shí)，該組分對整體滋味貢獻(xiàn)不明顯，當(dāng)TAV≥1時(shí)，該組分具有滋味活性，可能對樣本整體滋味具有顯著性貢獻(xiàn)，且值越高，貢獻(xiàn)越大[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和Origin pro 2018C軟件制表和繪圖，采用Origin pro 2018C軟件進(jìn)行PCA和聚類分析，采用MSD ChemStation軟件處理SPME-GC-MS數(shù)據(jù)，未知揮發(fā)性組分與NIST08.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行匹配。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子舌檢測及傳感器響應(yīng)值的分析

如圖1所示，自制的霉腐乳（M1）和市購2 種腐乳（C1、C2）口感較為接近，發(fā)酵后期的霉腐乳（M2）的苦、酸味值都遠(yuǎn)高于其他3 種腐乳，原因?yàn)樵谫A存后期未添加食用油封面，離開汁液的腐乳暴露在空氣中逐漸褐變造成的。

圖1 腐乳電子舌傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖Fig. 1 Radar diagram of electronic tongue sensor responses to fermented bean curd

圖2 基于電子舌的腐乳PCAFig. 2 Principal components analysis score plot of fermented bean curd based on electronic tongue sensor responses

由圖2可知，PC1和PC2對總體方差的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了99.97%，滿足大于85%的界限[22]，說明PC1和PC2幾乎包含了樣本的所有信息，可以以映出腐乳的整體滋味信息，其中PC1的方差貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)高于PC2，說明腐乳滋味在PC1上差距比PC2大[23]。DI值為98%，表明4 個(gè)腐乳樣本差異明顯，能夠用電子舌較好地區(qū)分，后期發(fā)酵霉腐乳（M2）和另外3 種腐乳相距很遠(yuǎn)，與圖1結(jié)果相似。

2.2 腐乳中的游離氨基酸組成

腐乳中的游離氨基酸主要是在其發(fā)酵過程中由蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的[24]，不同的氨基酸組成和含量賦予腐乳豐富的味覺層次，使其具有鮮美、醇和、濃郁、柔潤的滋味特征[25]。按游離氨基酸的呈味特征[26-27]，將17 種游離氨基酸分為鮮、甜、苦味3 組。如表2所示，4 種腐乳樣本中含有豐富的游離氨基酸，在檢測的17 種氨基酸中，除了Cys在C1和C2中未檢測到，其余氨基酸在4 個(gè)樣本中均有被檢出。有研究[28]表明，Glu（鮮味）、Asp（鮮味）、Ala（甜味）、Met（苦味）和Lys（苦味）是發(fā)酵豆制品中主要的游離氨基酸。M1中游離氨基酸總量最大，鮮味氨基酸含量最大，對滋味貢獻(xiàn)大的氨基酸依次為Glu、Val、Ala、His、Lys、Pro、Phe、Ile、Asp和Leu；M2中苦味氨基酸含量最大，該結(jié)論與電子舌分析結(jié)果一致，但苦味氨基酸含量過高會帶來不良風(fēng)味，影響腐乳整體口感，對滋味貢獻(xiàn)大的氨基酸依次為Glu、Lys、Val、Ala、Ile、Phe、Tyr、Met、Asp、Leu、Gly、His和Arg；C1中游離氨基酸總量最小，可能是腐乳配方中的某些環(huán)境因素降低了蛋白酶系的活力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解成短肽和氨基酸的能力下降，鮮味氨基酸含量最大，對滋味貢獻(xiàn)大的氨基酸只有Glu；C2中苦味氨基酸含量最大，對滋味貢獻(xiàn)大的氨基酸依次為Glu、Val、Ala、Tyr、Lys、Phe、Met、His、Asp、Ile、Leu、Ser、Pro和Gly，與M2相似，但TAV相對較小。4 種腐乳中對滋味貢獻(xiàn)最大的氨基酸均為Glu，Yamaguchi等[29]研究Glu是類似味精的鮮味物質(zhì)，與其鈉鹽提供鮮味，因此4 種腐乳獨(dú)特的滋味和鮮味氨基酸組分有一定關(guān)系。

2.3 SPME-GC-MS揮發(fā)性成分的分析

2.3.1 萃取頭對萃取效果的影響

不同萃取頭涂層的極性不同導(dǎo)致其吸附的組分種類和極性不同[32-33]。由圖3可知，不同萃取頭對腐乳的萃取效果存在顯著差異，其50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭得到的組分的總峰面積和峰數(shù)量都是最大的，因此，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭用于腐乳揮發(fā)性組分的測定分析。

圖3 萃取頭類型對腐乳揮發(fā)性組分萃取效果的影響Fig. 3 Effect of extraction fibers on the extraction efficiency of volatile compounds from fermented bean curd

2.3.2 腐乳揮發(fā)性組分的分析

經(jīng)GC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)4 種腐乳揮發(fā)性組分復(fù)雜，本研究所采用的分析條件能較好地分離這些組分。按NIST08.L標(biāo)準(zhǔn)庫檢索，結(jié)合RI對腐乳中的揮發(fā)性組分進(jìn)行的鑒定，結(jié)果見表3。4 種腐乳共鑒定出73 種揮發(fā)性組分，其中M1共鑒定出38 種，萜烯類占53.06%、芳香族占20.68%、醇類占9.00%、酯類占4.99%、烷烴類占4.11%、含氮化合物占2.53%、烯烴類占1.92%、酮類占1.60%、萘類占0.46%；M2鑒定出31 種，芳香族占55.72%、萜烯類占24.07%、烷烴類占7.51%、醚類占4.95%、醇類占3.89%、酯類占1.96%、烯烴類占1.05%、萘類占0.84%；C1共鑒定出27 種，醇類占59.19%、芳香族占25.17%、酯類占13.79%、萜烯類占1.40%、萘類占0.41%、烷烴類占0.04%；C2共鑒定出14 種，醇類占59.45%、酯類占40.40%、芳香族占0.12%、烷烴類占0.02%。M1中萜烯類和芳香族化合物的相對含量較高，M2中芳香族和萜烯類化合物的相對含量較高；C1中醇類和芳香族化合物的相對含量較高，C2中醇類和酯類化合物的相對含量較高。

表2 腐乳中游離氨基酸組成和含量及其對應(yīng)的TAVTable 2 Contents of free amino acids in fermented bean curd and their TAVs

表3 4 種腐乳揮發(fā)性組分的分析結(jié)果Table 3 Analysis of volatile compounds in four fermented bean curds

續(xù)表3

腐乳發(fā)酵過程中，氨基酸和湯料中的乙醇發(fā)生一系列復(fù)雜的生化以應(yīng)產(chǎn)生酯類、醇類和醛類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[35-36]。小分子質(zhì)量的酯類物質(zhì)具有獨(dú)特的氣味，如水楊酸甲酯（M1相對含量2.48%）、癸酸乙酯（M1相對含量0.15%、C1相對含量0.67%、C2相對含量0.05%）、3-苯丙酸乙酯（C2相對含量0.03%）有水果味及其他誘人的風(fēng)味；大分子質(zhì)量的酯類雖然氣味閾值高，香味弱，但含量高也可以產(chǎn)生特有的風(fēng)味，如棕櫚酸乙酯（C1相對含量8.75%、C2相對含量21.34%）有微弱果爵和奶油香味，9-十八酸乙酯（C2含7.80%）有淡淡的花味[37]。M1中萜烯類和芳香族化合物的相對含量較高，有可能是加入香辛料的原因，其中3-蒈烯的相對含量為43.45%，3-蒈烯多用于食用香精的配方[38]，M2中的3-蒈烯的相對含量也超過了10%，M1和M2中萜烯類化合物相對含量均高于C1和C2的萜烯類化合物含量，一定程度上說明M1和M2在生產(chǎn)中使用的香辛料用量大于C1和C2的香辛料用量。具有茴香特殊香氣[39]的茴香腦在M1、M2和C1中均被檢測到，相對含量分別為11.81%、44.91%和22.15%。具有玫瑰香氣的苯乙醇在M1中的相對含量為7.95%。C1和C2中乙醇的相對含量都超過了50%，酒香明顯，應(yīng)該是蛋白質(zhì)等物質(zhì)在發(fā)酵過程中分解產(chǎn)生的醇類物質(zhì)增加[39-40]，這與王倫興等[41]的研究結(jié)果一致。劉娜等[42]采用頂空SPME-GC-MS-嗅聞法測定紅腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明乙醇和酯類化合物是其主要貢獻(xiàn)成分。穆旻等[5]對紅腐乳中揮發(fā)性成分的提取和分析鑒定出的76 種揮發(fā)性成分中酯類有30 種、醇類10 種，與本實(shí)驗(yàn)測得的C1和C2的結(jié)果一致，2 種樣品中醇類和酯類占比不同，可能與2 種紅腐乳的生產(chǎn)工藝條件差異相關(guān)。M1和M2中烷烯類物質(zhì)可能是脂肪分解產(chǎn)生的[6]，但由于其風(fēng)味閾值較高，故對腐乳的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

2.3.3 PCA結(jié)果

運(yùn)用Origin pro 2018C軟件對4 種腐乳樣本揮發(fā)性成分的相對含量進(jìn)行PCA，由結(jié)果可知，PC1貢獻(xiàn)率為48.65%，PC2貢獻(xiàn)率為42.75%，PC3貢獻(xiàn)率為6.56%，PC4貢獻(xiàn)率為2.04%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為100%。如圖4所示，4 種腐乳中M1和M2分布在第2象限，與其相關(guān)性較高的揮發(fā)性組分是G10（3-蒈烯）和G9（1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環(huán)己二烯）；C1和C2分布在第1象限，與其相關(guān)性較高的揮發(fā)性組分為G67（棕櫚酸乙酯）、G1（乙醇）和G20（茴香腦）。

圖4 4 種腐乳的主成分雙標(biāo)圖Fig. 4 PCA score plots and loading plots of four fermented bean curds

2.3.4 聚類分析結(jié)果

圖5 4 種腐乳的聚類分析樹狀圖Fig. 5 Clustering dendrograms of four fermented bean curds

由圖5可知，當(dāng)4 種腐乳在類間間距為40時(shí)，腐乳樣本分為2 類，第1類為M1和M2，第2類為C1和C2；當(dāng)類間間距為30時(shí)，腐乳樣本分為3 類，第1類為M1，第2類為M2，第3類為C1和C2。聚類分析結(jié)果和GC-MS檢測結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用電子舌和SPME-GC-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對4 種不同品牌腐乳的滋味和揮發(fā)性組分進(jìn)行研究，比較自制霉腐乳和市售腐乳在滋味和風(fēng)味上的異同。結(jié)果表明，電子舌傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖和PCA圖能看出4 個(gè)腐乳樣本差異明顯，能夠用電子舌較好地區(qū)分，自制霉腐乳（M1、M2）的滋味特征有別于其他2 種；氨基酸分析結(jié)果表明4 種腐乳樣本中Glu的TAV最大，自制霉腐乳M1中鮮味氨基酸含量最大，M2中苦味氨基酸含量最大，此結(jié)果和電子舌分析結(jié)果一致；SPME-GC-MS共鑒定出73 種揮發(fā)性組分，其中酯類、醇類、萜烯類和芳香族類化合物相對含量較高，是構(gòu)成腐乳香氣的主要成分，自制霉腐乳中萜烯類和芳香族化合物的相對含量較高。利用PCA法得到的雙標(biāo)圖中可知自制霉腐乳M1和M2分布在同一象限，與其相關(guān)性較高的揮發(fā)性組分為3-蒈烯和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環(huán)己二烯；利用聚類分析能看出不同腐乳之間的親疏遠(yuǎn)近，其中自制霉腐乳M1和M2的揮發(fā)性成分最為接近。本研究結(jié)果為霉腐乳的研發(fā)和生產(chǎn)提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，3 種研究方法互為輔助，結(jié)合使用會使結(jié)果更全面、可靠。