譚 庶,楊金易,許吉華,沈玉棟,曾道平,蘇曉娜,鐘翠麗,許小炫,孫遠明,
(1.華南農業(yè)大學食品學院,廣東省食品安全重點實驗室,廣東 廣州 510642;2.吉安市公安局刑科所,江西 吉安 343000;3.溫氏食品集團股份有限公司,廣東 云浮 527499)
獸藥殘留是影響食品安全的一個重要因素,其中抗病毒藥物殘留問題尤為突出[1]。金剛烷胺是常用于動物治療的一種抗病毒藥物[2],在動物飼養(yǎng)過程中主要用于治療和預防禽流感和豬的傳染性胃腸炎。然而金剛烷類抗病毒藥物在動物養(yǎng)殖過程中違禁使用的現(xiàn)象普遍發(fā)生,在生物機體內以原藥形式蓄積的金剛烷胺可通過食物鏈進入人體,產生神經(jīng)毒性等毒副作用[3-5]。其濫用還間接導致全世界范圍內流感病毒的耐藥性日益嚴重[6-8]。2000—2012年間的流行病學調查表明,我國流感病毒對金剛烷胺的耐藥性由13.16%激增至80.00%,嚴重威脅人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展[9]。因此,2005年農業(yè)部560號公告規(guī)定禁止將金剛烷胺類藥物應用于動物的病毒性疾病的防治以及相關的生產、銷售等。2006年美國食品藥品監(jiān)督管理局也禁止在家禽養(yǎng)殖中使用金剛烷胺和金剛乙胺等人類抗病毒藥物[10]。
雞肉是中國主要食用肉類之一,因其高蛋白、低脂肪和低膽固醇的特點而廣受歡迎。作為世界第三大雞肉生產國,2017年我國雞肉產量達1 160萬 t[11]。然而在肉雞飼養(yǎng)過程中,金剛烷胺的違規(guī)使用依然屢禁不止。2012年“速成雞”事件[12]再次讓金剛烷胺的濫用成為了民眾輿論的焦點。2013年日本厚生勞動省醫(yī)藥食品局食品安全部發(fā)布通知,在進口食品監(jiān)控計劃中加入對中國產雞肉中金剛烷胺的檢查[13]?,F(xiàn)階段,我國尚未建立有關食品中金剛烷胺檢測的國家標準和行業(yè)標準,只有山東省和江蘇省分別建立了雞肉和雞肝中金剛烷胺殘留量的液相色譜-串聯(lián)質譜檢測法。隨著我國雞肉生產和消費量增大,為保障消費者健康安全和雞肉出口貿易的順利進行,對雞肉及其相關產品中的金剛烷胺殘留量監(jiān)測十分必要。
目前已報道的檢測雞肉組織中金剛烷胺殘留的方法主要包括:高效液相色譜[14]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)[15-17]、親水相互作用色譜-串聯(lián)質譜[13]、生物識別材料親和檢測[18]等。雖然這些方法可靠且準確,但通常采用復雜的樣品前處理和精密儀器并需要專業(yè)人員操作,檢測成本高,不適合大量樣品的快速檢測。近年來基于抗原-抗體特異性識別的基礎上發(fā)展的免疫檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附滴定[19-23]、免疫傳感器[24]、免疫層析試紙條[21-22]、免疫磁珠[25]、免疫比色分析[26-27]等。其中酶聯(lián)免疫吸附測定方法具有操作簡單、成本低廉且高檢測通量,是當前快速檢測的主要方法。在構建免疫檢測方法時,半抗原的設計與合成是關鍵步驟,直接決定了制備的抗體質量的優(yōu)劣[28-30]。報道[20-21]顯示半抗原的復雜空間結構和分子極性可能是產生高特異性抗體的關鍵,氨基的保留與否可能不影響抗體特異性,但大多數(shù)抗體表現(xiàn)出低親和力或對個別藥物具有高選擇性。
本研究通過分析現(xiàn)有的金剛烷胺半抗原及其抗體,設計并制備一種針對金剛烷胺分子特點的新型半抗原,利用產生的金剛烷胺特異性單克隆抗體,擬建立一種與現(xiàn)有檢測方法相比更為靈敏、適用性強的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法,為進一步研制雞肉中金剛烷胺殘留免疫檢測試劑盒提供理論依據(jù)。
雞肉樣品 市售;金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林等標準品 國藥集團化學試劑有限公司上海分公司;N-(1-金剛烷基)肼甲酰胺(N-(1-adamantyl)hydrazine carboxamide),ADHZ) 美國Matrix Scientific公司;乙醛酸(glyoxylic acid,GA) 上海麥克林生化科技有限公司;3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)由實驗室制備并保存;N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide,NHS)、碳化二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,EDC)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)等生化試劑美國Sigma公司;辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG(HRP-IgG) 碧云天生物技術研究所;96 孔微孔測定板 深圳金燦華實業(yè)有限公司;4 周齡SPF級Balb/c小鼠 廣東省醫(yī)學實驗動物中心;SP2/0小鼠骨髓瘤細胞由廣東省食品安全重點實驗室保存。
包被液:碳酸鹽緩沖液;底物顯色液:TMB顯色液;洗液:Na2HPO4·12H2O 3.0 g、NaCl 8.5 g、吐溫-20 0.5 mL,用蒸餾水定容至1 L;磷酸緩沖液(phosphate buffer,PB);磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS);B液:Na2B4O7·10H2O 4.92 g、H3BO33.09 g、蔗糖100 g、魚明膠4 g、酪蛋白5 g,用蒸餾水定容至1 L;P液:Na2HPO4·12H2O 6.2 g、NaH2PO4·2H2O 0.8 g、蔗糖100 g、魚明膠4 g、酪蛋白5 g,用蒸餾水定容至1 L;T液:三羥甲基氨基甲烷14.6 g、濃鹽酸8.8 mL、蔗糖80 g、魚明膠4 g、酪蛋白5 g,用蒸餾水定容至1 L。
JZ-II型均質器 莆田市南榮貿易有限公司;超低溫高速離心機 美國Eppenndorf公司;Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo公司;氮吹儀 康寧科技有限公司;QP50質譜儀 日本島津公司;1200系列液相色譜儀 美國Agilent公司;ZHJH-1122超凈工作臺上海新苗醫(yī)療器械公司。
1.3.1 金剛烷胺半抗原的制備與鑒定
半抗原ADHZ-GA合成路線如圖1所示。稱取ADHZ 10.00 mg、GA 4.00 mg、甲醇250 μL放入圓底燒瓶中,滴加幾滴冰乙酸,再置于磁力攪拌器上,室溫攪拌以應48 h,會有沉淀析出。將以應后的混合液在4 500 r/min離心15 min,棄去上清液,將沉淀于50 ℃真空干燥,最終得到白色固體粉末即為金剛烷胺半抗原,將半抗原溶解于合適有機溶劑,進行質譜鑒定。
圖1 金剛烷胺半抗原合成路線Fig. 1 Synthesis of hapten for amantadine detection
1.3.2 人工抗原的制備
參考史曉亞[31]的方法,采用活化酯法將金剛烷胺半抗原與BSA和KLH分別偶聯(lián),作為包被原和免疫原。稱取ADHZ-GA 6.6 mg(25 μmol),EDC 4.8 mg(25 μmol),NHS 2.9 mg(20 μmol)溶到1 mL DMF中,室溫下避光以應18 h,定為A液;稱量BSA 16.7 mg(0.25 μmol)或KLH 75.0 mg(0.025 μmol)溶于1 mL PBS,定為B液;把A液和B液混合,室溫攪拌以應3 h,再把此混合液倒入透析袋,并放入緩沖液中于4 ℃透析3 d,每隔8 h換1 次透析液,且透析液需提前置于4 ℃冰箱中。透析結束后移取透析袋中的上清液,并于4 ℃保存。
1.3.3 動物免疫與特異性單克隆抗體的制備
參考Peng Dapeng等[19]的方法,選取6~8 周齡的雌性Balb/c小鼠,將上述免疫原免疫3 只小鼠。先將KLH-抗原肽偶聯(lián)物免疫原時用生理鹽水稀釋成1 mg/mL,按每只小鼠注射100 mL的劑量,共免疫4 次。首次免疫加完全弗氏佐劑,皮下多點注射;2 周后免疫原加不完全弗氏佐劑,同樣皮下多點注射進行加強免疫。此后每2 周加強免疫1 次,在第4次免疫后1 周對小鼠進行剪尾收集血清,并使用ic-ELISA測定抗血清滴度。在細胞融合前3 d對產生最高滴度抗血清的小鼠加強免疫,直接腹腔注射0.5 mL相應抗原(不加佐劑)。以10∶1的比例將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,并在37 ℃、5% CO2條件下的HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在融合約7 d后,用ic-ELISA選擇和標記效價高、抑制率高的陽性雜交瘤細胞。陽性細胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3 次均為100%的陽性后,建立細胞株并凍存。并將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔,制備腹水,使用Protein G親和層析法純化單抗備用。
1.3.4 特異性單克隆抗體免疫學特性的鑒定
1.3.4.1 抗體腹水效價及親和力鑒定
用紫外分光光度法測定純化后的單克隆抗體蛋白濃度,采用ic-ELISA法測定抗體腹水的效價及抗體親和力,用親和常數(shù)Ka表示親和力的大小。
1.3.4.2 特異性測定
選擇與金剛烷胺具有類似結構或功能的8 種藥物金剛乙胺、利巴韋林、嗎啡胍、諾氟沙星、氟苯尼考、喹乙醇代謝物、氯霉素進行ic-ELISA測定,通過各種藥物的標準曲線分別得到其IC50,交叉以應率計算公式如下:
1.3.5 ic-ELISA基本步驟
包被:用包被液將包被抗原稀釋至相應的最適濃度,包被96 孔酶標板,每孔100 μL,4 ℃過夜孵育;封閉:經(jīng)每孔300 μL洗液洗滌2 次后,每孔加入120 μL封閉液,37 ℃孵育3 h,甩干孔中的液體,置于37 ℃烘箱中2 h備用;競爭以應:加入金剛烷胺標準品或樣品溶液(50 μL/孔),再加入50 μL稀釋好的抗體工作液,25 ℃以應一定時間;加酶標二抗:洗滌5 次,每孔加入100 μL用P液稀釋好的酶標二抗25 ℃以應20 min;顯色:洗滌5 次,每孔加入顯色液100 μL,25 ℃顯色10 min。
終止以應:每孔加入50 μL終止液(10% H2SO4),酶標儀測定OD值。以金剛烷胺標準品質量濃度的對數(shù)值為橫坐標(X),以抑制率為縱坐標(Y),應用Origin 8.5軟件中的四參數(shù)擬合競爭標準曲線。
1.3.6 ic-ELISA法優(yōu)化
1.3.6.1 包被原及單克隆抗體的稀釋倍數(shù)組合
利用方陣滴定對包被抗原、抗體的最適工作濃度進行優(yōu)化,將包被用偶聯(lián)抗原用包被緩沖液分別按1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000稀釋,抗體分別按1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000 和1∶40 000稀釋,按照1.3.5節(jié)的步驟操作,測定0 μg/L和48.6 μg/L的金剛烷胺標準品在450 nm波長處的吸光度。
1.3.6.2 優(yōu)化藥物稀釋液、抗體稀釋液、二抗稀釋倍數(shù)、競爭時間
選擇去離子水、PBST、PBS和PB作藥物稀釋液配制標準品,選擇T液、P液和B液作抗體稀釋液配制抗體溶液,分別用P液稀釋酶標二抗不同倍數(shù),選擇競爭時間為20、25、30 min和40 min,按照1.3.5節(jié)步驟操作,以Amax、IC50及Amax/IC50作為評價各影響因素的標準。選擇Amax在1.5~2.0之間,Amax/IC50最高,IC50最低時的條件為ic-ELISA的最佳以應條件。
1.3.7 樣品前處理
將雞胸肉去除脂肪并勻漿化,準確稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中,加入6 mL乙腈,100 μL 0.1 mol/L鹽酸,劇烈振蕩2 min,室溫4 000 r/min離心5 min;取4 mL上清液于離心管中,于60 ℃氮氣或空氣吹干;加入0.5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液,充分渦動30 s;取50 μL進行ic-ELISA分析。
向空白雞肉樣品中分別添加高、中、低3 個質量濃度的金剛烷胺標準品,經(jīng)前處理后用同一批次包被酶標板對同批樣品進行檢測,每個樣品設4 個重復,計算批內變異;用不同批次包被酶標板對同批樣品進行檢測,每個樣品設4 個重復,計算批間變異。
1.3.8 儀器方法確證
雞肉中金剛烷胺含量的儀器方法測定參照DB 21/2394—2014《雞肝和雞肉中金剛烷胺、金剛乙胺的檢測 超高效液相色譜串聯(lián)質譜法》進行。
根據(jù)樣品A450nm值,由標準曲線查出相應的質量濃度,乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際質量濃度,使用Origin 8.5軟件繪制相關ic-ELISA圖表。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SAS 6.12軟件計算完成。
比較其他文獻中的金剛烷胺半抗原(表1)可知,這些半抗原的共同結構由金剛烷組成,表明金剛烷在動物免疫系統(tǒng)以應中可能比氨基更重要。Wu Songsong等[22]直接采用戊二醛的醛基與金剛烷胺和載體蛋白氨基縮合成Schiff堿而進行共價交聯(lián)合成金剛烷胺全抗原,其抗體靈敏度較低,IC50為11.93 μg/L;Peng Dapeng等[19]研究表明加入丁二酸酐與金剛烷胺氨基結合生成酰胺作為金剛烷胺半抗原,IC50為15.8 μg/L,這可能因為用來產生抗體的半抗原具有相對低的分子極性,這對產生高親和力的抗體無益。Wang Zhaopeng等[20]將4-(氯磺酰基)苯甲酸與金剛烷胺在4-二甲氨基吡啶催化下磺?;铣山饎偼榘钒肟乖?,其IC50為0.84 μg/L;Xu Liguang等[21]研究表明加入二碳酸二叔丁酯保護氨基,然后加入6-溴己酸乙酯偶聯(lián),水解酯鍵得到金剛烷胺半抗原,其IC50為1.92 μg/L;但是這兩者半抗原合成路線復雜且與金剛乙胺交叉較大,不利于實際檢測。說明半抗原連接臂的結構選擇和長度與抗體特異性有關。
基于金剛烷是抗原決定簇的假設,而且ADHZ與金剛烷胺結構類似,直接設計了半抗原ADHZ-GA(圖1),為了在人工抗原表面突顯出半抗原的特征結構,以利于產生具有高特異性的抗體[31],半抗原引入席夫堿結構、羧基暴露分子結構,增加了特異性抗體產生的免疫原性。本研究所制備半抗原經(jīng)層析初步鑒定純度后,再經(jīng)質譜手段進行結構的鑒定。結果顯示成功制得目標半抗原。
表1 金剛烷胺半抗原對比Table 1 Comparison of haptens used for determination of AMA
研究結果表明,融合細胞經(jīng)3 次克隆后陽性率達100%,分離得到穩(wěn)定分泌抗金剛烷胺抗體的雜交瘤細胞,命名為3E7。
2.3.1 腹水效價及單抗質量濃度
采用間接ELISA法檢測純化后抗體腹水效價,結果表明,效價在1.60×106以上。用紫外分光光度法測定純化后單抗蛋白質量濃度為4.9 mg/mL。
2.3.2 親和力鑒定
本研究利用競爭性ELISA測定單克隆抗體親和力,根據(jù)公式計算單克隆抗體3E7的親和常數(shù)為4.92×107L/mol,一般認為親和力高的抗體親和常數(shù)在107~1012L/mol之間,親和力較好。
2.3.3 特異性鑒定
表2 金剛烷胺單克隆抗體ic-ELISA交叉反應率Table 2 Cross-reactivity of monoclonal antibody determined by ic-ELISA
由表2可知,制備的金剛烷胺抗體特異性好,但是金剛烷胺與金剛乙胺其交叉以應率為29.89%,這是因為該物質為金剛烷胺一結構類似物,其結構極其類似,僅比金剛烷胺多出一個亞甲基,所以存在少量交叉,但在實際檢測中,金剛乙胺較少使用在禽病的預防與治療。除金剛乙胺以外,與結構類似物和功能類似物的交叉以應率均小于0.01%,受其他化合物的影響小,不易出現(xiàn)假陽性、錯檢等現(xiàn)象。
依據(jù)實際ic-ELISA檢測的經(jīng)驗,為后續(xù)繪制標準曲線時,當0 μg/L的標準液A450nm值為1.6~2.2,最高質量濃度標準溶液(48.6 μg/L)的A450nm值在0.1~0.3之間時,繪制標準曲線的梯度和線性關系較好。
表3 包被抗原稀釋倍數(shù)及抗體稀釋倍數(shù)的確定(n=2)Table 3 Determination of optimal dilution of coating antigen and monoclonal antibody (n= 2)
由表3可以看出,當包被抗原稀釋80 000 倍,單抗稀釋20 000 倍時陰性標準液和質量濃度為48.6 μg/L的標準液的A450nm值分別為1.846和0.248,陰陽對照品的A450nm值之比最大。因此最佳包被原稀釋倍數(shù)為80 000,抗體工作質量濃度為122.5 μg/L。
抗體和藥物在不同緩沖體系里分散能力不同,所以需要選擇抗體和藥物最適合的溶劑;以應時間長短決定抗原抗體是否充分結合,所以要優(yōu)化競爭以應時間達到最佳以應程度。蛋白質性質不同,抗原抗體以應所需最佳質量濃度、緩沖體系、離子濃度、以應時間等參數(shù)也有所差異。不同藥物稀釋液條件下Amax、IC50和Amax/IC50的比較如圖2所示,選擇PB作為藥物稀釋液時,其IC50較低,同時Amax/IC50最高,故選擇PB作為藥物稀釋液;不同抗體稀釋液、二抗稀釋倍數(shù)和競爭時間條件下Amax、IC50和Amax/IC50的比較如圖3~5所示,同理可得出抗體稀釋液為P液,酶標二抗稀釋倍數(shù)為8 000,競爭時間30 min為最佳以應條件。
圖2 金剛烷胺標準品稀釋液的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of dilution of amantadine standard
圖3 抗體稀釋液的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of dilution solution for monoclonal antibody
圖4 酶標二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of dilution degree of enzyme-labelled antibody
圖5 競爭時間的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of competition time
按照上述ELISA條件優(yōu)化結果,得到金剛烷胺間接競爭ELISA法的最佳以應條件,即包被抗原與單抗最佳工作質量濃度分別為12.5 μg/L和122.5 μg/L,標準品稀釋液為PB緩沖液,抗體稀釋液為P液,酶標二抗稀釋倍數(shù)為8 000,最佳競爭時間為30 min。在此最佳以應條件下繪制標準曲線,其曲線的回歸方程為:Y=-28.914X+42.313,相關系數(shù)R2為0.994 6,IC50為0.69 μg/L,線性檢測范圍(IC20~IC80)為0.07~6.15 μg/L。
ic-ELISA法準確度以回收率表示,選擇高、中、低3 個添加水平進行金剛烷胺添加回收實驗,結果如表4所示。其中所測樣品中金剛烷胺平均回收率在101.69%~108.71%之間,且批間和批內變異系數(shù)低于15%。方法準確度能達到檢測要求,適用于實際樣品中金剛烷胺的檢測。
表4 金剛烷胺的實際雞肉樣品回收率和變異系數(shù)(n=4)Table 4 Recoveries and coefficients of variation for AMA in chicken samples (n= 4)
批內變異測定:每一標準品質量濃度作6 次重復,以其批內變異系數(shù)表示批內誤差;批間變異測定:按照上述優(yōu)化條件分別作標準曲線,取不同批次包被的酶標板,每個標準品質量濃度每天作一次分析,連續(xù)進行6 d測定,綜合6 d測得質量濃度進行分析,以其批間變異系數(shù)表示批間誤差。如表5所示,當金剛烷胺質量濃度為0.2、0.6 μg/L時,變異較大,當質量濃度在1.8~16.2 μg/L范圍內,變異系數(shù)均小于10%,表明該方法重復性較好。通過在同一個實驗室內,在適當長的時間間隔內(每天)和實驗所確立的條件下,不同時間內建立的標準曲線,如表6所示,IC50、Amax的變異系數(shù)均小于15%,表明在不同時間內進行檢測,試劑盒的性能(IC50、Amax)比較穩(wěn)定,實驗室內重復性較好。
表5 樣品測定批內變異(n=6)Table 5 Intra-assay coef fi cients of variation of the standard curve (n= 6)
表6 樣品測定批間變異(n=6)Table 6 Inter-assay coef fi cients of variation of the standard curve (n= 6)
從市場購得的100 只肉雞,收集雞胸肉并均質化,-20 ℃保存。按照實驗建立的ic-ELISA法檢測所有雞肉樣品中金剛烷胺,以DB 21/2394—2014的檢出限(0.5 μg/kg)作為陰陽性判定值,其中檢出9 份樣品為陽性,91 份樣品為陰性,將可疑樣品和9 份陰性樣品分別再用ic-ELISA法和HPLC-MS法檢測,進行統(tǒng)計學分析比較測定結果。以HPLC-MS所測得的金剛烷胺含量為Y軸,以ic-ELISA測得的金剛烷胺含量為X軸,繪制散點圖。對2 種方法的測定結果進行線性回歸分析,如圖6所示?;貧w方程為:Y=0.81X-0.03,R2=0.970 2,說明建立的ic-ELISA法的測定結果準確可靠。
圖6 ic-ELISA與HPLC-MS方法對比Fig. 6 Comparison between ic-ELISA and HPLC-MS
本實驗通過設計并合成一種新型的金剛烷胺半抗原,制備特異性的金剛烷胺特異性單克隆抗體,通過優(yōu)化ic-ELISA以應條件,建立檢測雞肉中金剛烷胺殘留的ic-ELISA法。該方法的IC50為0.69 μg/L,線性檢測范圍為0.07~6.15 μg/L,檢出限為0.21 μg/L;除金剛乙胺外,與其余結構及功能類似物均無交叉以應,方法特異性好;雞肉中金剛烷胺的添加回收率為101.69%~108.71%,批間和批內變異系數(shù)均小于15%;實際樣品檢測中,ic-ELISA與HPLC-MS方法檢測結果符合,整個檢測以應時間需60 min左右。這些數(shù)據(jù)表明本實驗建立金剛烷胺殘留檢測方法的準確度、精密度、靈敏度較高,可用于雞肉中金剛烷胺殘留的快速定量檢測。