磁性氧化石墨烯的制備及用于乳制品中鄰苯二甲酸酯類塑化劑的測定

于 玲，邢翠娟，何 旭，董麗麗，趙 哲，申文龍，邊曉巧

（邢臺學院化學與化工學院，河北 邢臺 054001）

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是一類人工合成有機化合物，添加后可使微粒分子更均勻分布，因此具有增加延展性、柔韌性和彈性的功效，加之其成本低廉，常作為增塑劑和軟化劑應(yīng)用于塑料工業(yè)。然而，該類物質(zhì)會干擾神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常調(diào)節(jié)，部分PAEs及其主要代謝物和降解產(chǎn)物可引起多種器官系統(tǒng)的毒性作用，包括肝臟、生殖道、腎臟和心臟，這引起了人們對PAEs導致生殖和發(fā)育不良可能性的極大關(guān)注[1]。近年來，琳瑯滿目的乳制品因其營養(yǎng)美味走進尋常百姓家。然而，乳制品大多由塑料盒或塑料袋包裝，而PAEs具有脂溶性，很容易從塑料包裝遷移到乳制品中；另外，在乳制品的生產(chǎn)過程中不可避免的會使用塑料工具進行采奶、加工和貯存，這些環(huán)節(jié)都會導致PAEs溶入乳制品中進而危害人體健康。因此，我國于2008年針對不同種類添加劑在包裝材料中的使用和管控發(fā)布了相關(guān)標準GB 9685—2008《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標準》[2]，其中對部分PAEs從包裝材料到食品的特定遷移量做了嚴格的規(guī)定。

氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一種可以通過天然石墨氧化合成的層狀化合物，其基面和邊緣裝飾有各種含氧官能團，可與有機分子間形成π-π作用，具有新穎的質(zhì)量遷移特性，在吸附和分離方面潛力巨大。磁性材料具有快速分離性能，引入磁性材料是提高分離實驗效率的重要手段，將GO和磁性材料Fe3O4結(jié)合起來形成一種新型復合材料，即磁性氧化石墨烯（magnetic graphene oxide，F(xiàn)e3O4/GO），其兼具GO的超強吸附性能和磁性材料的快速分離性能，可作為一種高萃取率的新型材料。近年來，F(xiàn)e3O4/GO在分析化學領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。Wu Jianrong等[3]將Fe3O4/GO與離子液體相結(jié)合，提取、測定生物樣品中5 種頭孢菌素；Guo Lihui等[4]將Fe3O4/GO與分子印記聚合物結(jié)合用于富集水中6 種PAEs；Lamei等[5]采用深度共晶溶劑改性Fe3O4/GO用于測定尿和血漿中的美沙酮；Zhang Xiaoting等[6]采用Fe3O4/GO作為基質(zhì)分散固相萃取的吸附劑從食物樣品中提取5 種偶氮染料。

目前，食品中PAEs的樣品前處理方法主要有固相萃取法[7-8]、固相微萃取法[9-12]和分散液液微萃取法[13-15]等。這些方法或操作耗時費力，或有機試劑消耗量大污染環(huán)境，或只適用于簡單基質(zhì)樣品，它們通常涉及許多步驟，導致分析物的損失。因此，樣品前處理的發(fā)展趨勢是集中開發(fā)更簡單、更可靠、更快速、更經(jīng)濟的方法。乳制品基質(zhì)復雜，脂肪和蛋白質(zhì)含量高，能否高效去除這些雜質(zhì)是實驗成敗的關(guān)鍵。由Anastassiades等[16]開發(fā)的QuEChERS方法已成為測定不同樣品基質(zhì)中待測物的一種非常流行的技術(shù)。該方法包括2 個連續(xù)步驟：鹽析液液萃取和分散固相萃取凈化，其核心原理是根據(jù)目標化合物的分配機制，通過加入萃取劑和吸附材料等凈化劑去除雜質(zhì)。該方法取代了傳統(tǒng)方法中許多復雜的操作步驟，分析成本低，只需要少量溶劑和簡單的玻璃容器，時間成本低，工作量小。目前QuEChERS方法已普遍應(yīng)用于果蔬、糧谷、水產(chǎn)品及環(huán)境中農(nóng)藥殘留的檢測[17-24]。

本實驗以石墨為原料，采用Hummers方法和化學共沉淀法逐步合成Fe3O4/GO。通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）和拉曼光譜（Raman spectroscopy，RS）等方法對其結(jié)構(gòu)進行表征，利用Fe3O4/GO改進QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用實現(xiàn)對乳制品中16 種PAEs的定性和定量分析。本研究基于Fe3O4/GO的特性改進QuEChERS技術(shù)，充分發(fā)揮Fe3O4/GO對牛奶基質(zhì)較強的去除能力和對目標組分有效的保留能力。Fe3O4/GO在完成凈化程序后可以通過施加外部磁場替代傳統(tǒng)的離心步驟達到吸附劑從溶液中快速分離的效果，該方法簡便快捷、準確可靠，尤其適合用于乳制品這樣基質(zhì)復雜的樣品分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用純牛奶、酸奶、乳飲料等20 種乳制品均購自邢臺某超市。

16 種PAEs混合標準品（1 000 μg/mL，批號1701066）：鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯（dimethylglycol phthalate，DMEP）、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯（bis(4-methyl-2-pentyl)phthalate，BMPP）、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯（bis(2-ethoxyethyl) phthalate，DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（di-n-hexyl phthalate，DNHP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（butyl benzyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯（bis(2-butoxyethyl) phthalate，DBEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯 （di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPHP）、鄰苯二甲酸正辛酯（di-n-octylo phthalate，DNOP）、鄰苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP） 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～60 μm） 武漢市偉琪博星生物科技有限公司；無水MgSO4、濃硫酸、石墨粉 天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；乙腈、KNO3、KMnO4、30% H2O2、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水（均為分析純） 天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 GC-MS聯(lián)用儀、XRD-6100射線衍射儀 日本島津公司；WQF-510A FTIR 北京瑞利分析儀器有限公司；INVIA顯微共焦拉曼光譜儀 英國Renishaw公司；SC-3612低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；KQ-50E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4/GO的制備

采用Hummers法[25]制備GO。將盛有120 mL濃硫酸的燒杯放置到預(yù)先準備好的冰水浴中，將4 g石墨粉和2 g KNO3混合，緩慢加入到濃硫酸中，調(diào)節(jié)攪拌速度，均勻攪拌30 min。分批緩慢將12 g KMnO4加入濃硫酸中，為防止氧化以應(yīng)劇烈，整個過程完全在冰水浴條件下進行，繼續(xù)攪拌2 h。為了使其充分氧化，把容器放入預(yù)熱好的40 ℃恒溫水浴鍋中，以應(yīng)24 h。以應(yīng)結(jié)束后，依次加入400 mL超純水和30 mL雙氧水，混合均勻，靜置4 h，洗滌沉淀至中性，真空干燥制得GO。

采用化學共沉淀法制備Fe3O4/GO[26]。在500 mL超純水中加入1.5 g GO，超聲30 min；另在500 mL超純水中加入10 g FeCl3·6H2O和4 g FeCl2·4H2O超聲1.5 h，使其完全溶解。各取上述2 種溶液各200 mL混勻，再加入30%的氨水調(diào)節(jié)pH值至9～10，超聲2 h后靜置，洗滌沉淀至中性，真空干燥制得Fe3O4/GO。

1.3.2 GC條件

色譜柱：RXI-5si1MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃保持10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣口溫度280 ℃；恒壓模式；進樣量1 μL；不分流進樣。

1.3.3 MS條件

離子源溫度230 ℃；離子源接口溫度280 ℃；定性采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍40～400m/z；定量采用選擇離子監(jiān)測模式（selected ion monitoring，SIM）；溶劑延遲3 min；16 種PAEs的保留時間和SIM參數(shù)見表1。

表1 16 種PAEs的保留時間和SIM參數(shù)Table 1 Retention times and selected ion monitoring parameters for 16 PAEs

1.3.4 標準溶液的配制

取1 000 μg/mL的PAEs混合標準溶液0.1 mL，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標準儲備液，置于4 ℃冰箱保存。將標準儲備液分別用乙腈和空白基質(zhì)溶液稀釋至20、50、100、200、500、1 000 μg/L的標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.5 樣品前處理

準確稱取1.000 0 g試樣于10 mL玻璃離心管中，加入2 mL乙腈，充分振蕩，再加入0.2 g NaCl，明顯觀察到鹽析現(xiàn)象，然后3 000 r/min離心3 min，收集上清液，待凈化。取上述乳制品上清液1 mL，分別加入30 mg PSA、25 mg Fe3O4/GO、100 mg無水MgSO4，超聲3 min，通過外加磁場使之分離，取1 μL注入GC-MS。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）

通過GC-MS分別測定乙腈、空白基質(zhì)標準工作液的PAEs離子響應(yīng)強度，從而得到2 種系列標準工作液的標準曲線，通過兩者標準曲線斜率比得出ME。計算公式如下：

式中：K乳制品基質(zhì)為乳制品空白基質(zhì)標準曲線斜率；K乙腈為乙腈溶劑標準曲線斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料表征

2.1.1 Fe3O4/GO的FTIR分析

由圖1可知，3 397 cm-1處為—OH的伸縮振動峰，說明—OH與鄰近的水分子中氧原子生成了氫鍵。曲線于1 211、1 463 cm-1以及1 587 cm-1附近出現(xiàn)的3 個峰，分別歸屬于GO的C—O—C、COO-和C＝O的伸縮振動。此外，在576 cm-1處還可觀察到由Fe—O伸縮振動所引起的Fe3O4特征峰，由此可以證明Fe3O4已經(jīng)成功負載在GO上。

圖1 Fe3O4/GO的FTIR圖Fig. 1 FTIR spectrum of Fe3O4/GO

2.1.2 Fe3O4/GO的XRD分析

通過XRD對合成的GO和Fe3O4/GO結(jié)構(gòu)進行分析對比。由圖2可知，虛線顯示在2θ為10.6°處觀察到了GO所具有的典型單個衍射峰。實線顯示Fe3O4/GO在2θ為30.3°、35.5°、43.2°、53.5°、57.3°和62.8°處有顯著的波峰，這與Fe3O4納米粒子的XRD圖譜一致[27]，說明該復合材料中已成功引入Fe3O4。同時，在2θ為10.6°處沒有發(fā)現(xiàn)GO的特征衍射峰。這是由于Fe3O4的影響使GO的有序堆積受到了破壞從而導致衍射峰消失。XRD分析結(jié)果可進一步表明該復合材料為Fe3O4/GO。

圖2 GO和Fe3O4/GO的XRD圖Fig. 2 XRD patterns of GO and Fe3O4/GO

2.1.3 Fe3O4/GO的RS分析

RS是表征GO及其共價衍生物的最有效方法之一。如圖3所示，2 條曲線在1 300 cm-1和1 600 cm-1附近均出現(xiàn)2 個明顯的吸收峰，前者為GO的D峰而后者則對應(yīng)于其G峰。兩者的相對強度之比R（ID/IG）可以映材料微觀結(jié)構(gòu)的無序化程度。普遍認為，R值越高，材料中所存在的缺陷就越多，無序化的程度也越高[28]。本研究中，F(xiàn)e3O4/GO的R值為2.3，相較于GO的R值（1.4）有所升高，表明經(jīng)過磁性處理后引起sp2平面域產(chǎn)生更多的缺陷致使其結(jié)構(gòu)域紊亂，這可以理解為GO中引入大量Fe3O4所致。

圖3 GO和Fe3O4/GO的RS圖Fig. 3 Raman spectra of GO and Fe3O4/GO

2.2 提取劑的選擇

目前對樣品中PAEs使用較多的提取試劑為乙腈、正己烷和乙酸乙酯3 種。本研究采用以上3 種試劑對加標乳制品樣品進行分析檢測。結(jié)果表明，采用乙腈提取時塑化劑回收率較高，達到64.4%～97.6%；采用正己烷提取時回收率偏低，為58.3%～73.6%；而乙酸乙酯對乳制品中蛋白質(zhì)的提取量較大，雜質(zhì)干擾嚴重，且氣味刺鼻，故選取乙腈作為提取劑。在后續(xù)操作中NaCl作為鹽析劑使乙腈與水層明顯分離，無乳化現(xiàn)象，供進一步凈化使用。

2.3 凈化劑用量的選擇

在QuEChERS凈化中，考察吸附劑PSA、無水MgSO4以及Fe3O4/GO的用量對PAEs回收率的影響。在考察一個條件時，其他條件均保持不變且采用已優(yōu)化的結(jié)果。

2.3.1 PSA用量的優(yōu)化

雖然乳制品中大多數(shù)蛋白質(zhì)已經(jīng)在乙腈提取時去除，但仍會有少量蛋白質(zhì)和脂肪酸被萃取到乙腈提取液中?；赑SA對有機酸、脂肪酸有較強的吸附性，分別考察PSA用量為10、20、30、40、50 mg時，對PAEs回收率的影響。結(jié)果表明：PSA用量為10、20 mg時，部分PAEs回收率低于50%；隨著PSA用量的增加，回收率明顯提高，當PSA用量為30 mg時，回收率達到最優(yōu)為65.4%～116%；繼續(xù)增加PSA用量，會導致DEHP的回收率偏高為125%，故PSA用量選擇30 mg。

2.3.2 無水MgSO4用量的優(yōu)化

無水MgSO4吸水能力比較強，且與有機物不發(fā)生以應(yīng)，故可用于除去基質(zhì)溶液中的水分。考察無水MgSO4用量為100、150、200 mg時，對PAEs回收率的影響。無水MgSO4的用量為150、200 mg時，DEP、DBP兩種塑化劑回收率均大于140%；而用量為100 mg時，16 種PAEs回收率為71.9%～118.4%，故無水MgSO4用量選擇100 mg。

2.3.3 Fe3O4/GO用量的優(yōu)化

采用Fe3O4/GO作為新型雜質(zhì)吸附劑改進QuEChERS方法，在獲得滿意回收率的同時也達到了良好的除雜效果。在最佳前處理條件下，凈化前后純牛奶空白基質(zhì)標準添加（500 μg/L）總離子流色譜圖見圖4。經(jīng)凈化處理后雜質(zhì)峰明顯變少且對16 種目標組分有更大的保留。同時，借助外加磁場可以使吸附劑從溶液中快速分離，有效減少了前處理的時間?？疾霧e3O4/GO用量分別為10、15、25、40 mg時，對PAEs回收率的影響。結(jié)果表明，隨著Fe3O4/GO用量的增加，16 種PAEs回收率逐漸升高。但用量為10、15 mg時，BMPP、DBEP和DEHP 3 種塑化劑回收率低于60%；用量為25、40 mg時回收率在78%～112%之間，且兩者無太大差異，為節(jié)約成本，故Fe3O4/GO用量選擇25 mg。

圖4 凈化前（A）、凈化后（B）純牛奶空白基質(zhì)標準添加（500 μg/L）總離子流色譜圖Fig. 4 Total ion current chromatograms of PAEs extracted from puremilk blank matrix with standard addition (500 μg/L) before (A) and after (B) purification

2.4 樣品ME

由于樣品中存在部分基質(zhì)，會對待測物造成增強或抑制，將乙腈與純牛奶空白基質(zhì)溶液分別配制的標準溶液進行檢測，按照1.3.6節(jié)方法，將兩者的響應(yīng)值相比較，結(jié)果見表2。16 種PAEs表現(xiàn)出不同程度的基質(zhì)增強效應(yīng)，ME為1.15～1.56，為消除純牛奶基質(zhì)的影響，采用空白基質(zhì)標準曲線進行研究。

2.5 線性范圍及檢出限

以空白基質(zhì)標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到標準曲線方程，16 種PAEs在20～1 000 μg/L具有良好的線性關(guān)系，R≥0.998 4。按3 倍信噪比計算得到16 種PAEs的檢出限為0.5～2.5 μg/kg，按10 倍信噪比計算得到其定量限為2.0～7.5 μg/kg，具體參數(shù)見表2。

表2 線性系數(shù)、ME、檢出限及定量限Table 2 Linearity parameters, detection limits and quantitation limits

2.6 準確度和精密度測定結(jié)果

按照最佳前處理條件，在純牛奶空白樣品中進行加標回收率實驗，分別添加3 個水平（50、100、200 μg/kg）的16 種PAEs混合標準溶液，每一濃度平行實驗6 次，結(jié)果如表3所示。標準添加回收率在85.7%～117.7%之間，相對標準偏差不大于7.6%，準確度精密度良好，可滿足乳制品中16 種PAEs的日常監(jiān)測。

表3 加標回收率和精密度實驗（n=6）Table 3 Recoveries and precision of 16 PAEs from spiked blank samples (n= 6)

續(xù)表3

2.7 與其他方法的比較

本實驗與文獻報道的方法進行比較，結(jié)果見表4。本實驗有機試劑用量少，每處理1 g樣品，采用分散液液微萃取方法，需要有機試劑約4.6 mL；采用經(jīng)典QuEChERS方法，需要有機試劑約4 mL；采用本實驗方法僅需2 mL乙腈，綠色環(huán)保。其次，本實驗凈化劑用量少，除雜效果好，節(jié)約實驗成本；最后，快速的磁性分離取代了傳統(tǒng)的離心，節(jié)約了時間成本。

表4 本實驗方法與其他文獻方法比較Table 4 Comparison of this method with existing methods in the literature

2.8 實際樣品的測定結(jié)果

選用最佳前處理條件對實際樣品進行檢測，對市售的20 種純牛奶、酸奶、乳飲料進行分析。測定結(jié)果表明，20 種乳制品均含有DBP和DIBP，其中DBP含量在28.9～102.8 μg/kg之間，低于國家標準規(guī)定的限定值0.3 mg/kg[2]，DIBP含量在53.3～83.8 μg/kg之間，而DIBP國家暫無明確的允許遷移限量。部分乳制品中含有DEHP，含量為42.9～251.8 μg/kg，低于國家標準規(guī)定的遷移量1.5 mg/kg[2]。

3 結(jié) 論

本研究成功制備并表征了Fe3O4/GO并將其用于QuEChERS前處理技術(shù)，充分發(fā)揮了兩者磁分離和凈化的優(yōu)勢，再結(jié)合GC-MS建立了對乳制品中16 種PAEs的分析檢測方法。該方法的平均回收率為85.7%～117.7%，相對標準偏差不大于7.6%，整個前處理過程控制在8 min內(nèi)，且只需2 mL乙腈和155 mg凈化劑，該方法將提取、分離和凈化合并到一個步驟，省時高效的同時也保證了良好的凈化能力，是對經(jīng)典QuEChERS方法的擴展和應(yīng)用。