包覆花色苷W1/O/W2型乳液的消化特性及其緩釋效果

徐偉麗，張玉琪，朱元昊，魯兆新

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

花色苷（anthocyanins，ACNs）是一類水溶性色素，廣泛分布于花卉、水果、蔬菜和谷物中[1]。自然界中主要的ACNs是黃酮基(2-苯基-苯并吡咯基)鹽的多羥基糖苷和多乙氧基衍生物[2]。流行病學(xué)研究表明，ACNs對許多慢性疾病都有改善作用，如心血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和癌癥等[3-4]，特別是飲食和局部應(yīng)用ACNs可有效抑制皮膚或胃腸道癌癥[5-6]。ACNs的生物活性使其成為功能性食品中最有效的成分之一。然而，一旦ACNs與原始植物組織分離而不進行有效的保護則很難穩(wěn)定下來。光照、溫度、堿性條件以及氧氣或酶的存在都對ACNs的穩(wěn)定性和活性起著至關(guān)重要的作用[7-8]。此外，提取的ACNs經(jīng)人體消化系統(tǒng)處理后其生物活性也會遭到破壞[9-10]。因此，探索一種穩(wěn)定ACNs的有效封裝技術(shù)對ACNs的商業(yè)應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。

W1/O/W2型乳液已被證明是保護和控制親水性生物活性化合物釋放的最佳微膠囊技術(shù)之一，可通過將油包水（W1/O）單乳液在連續(xù)水相（W2）中分散而形成[11-12]。同時，體外消化模型作為一種了解膠囊組分理化變化和控制釋放的工具，也引起了人們的廣泛關(guān)注[13-14]。目前研究雖已表明，內(nèi)水相、油相和乳化劑的理化性質(zhì)都對經(jīng)胃腸道消化的膠囊化生物活性成分的包封率、穩(wěn)定性和釋放起著至關(guān)重要的作用[15-18]，但對W1/O/W2型乳液的微觀結(jié)構(gòu)變化研究較少。對于W1/O/W2型乳液從口腔到胃腸道的消化，尤其是小腸消化模型中有無脂肪酶的比較研究信息有限。此外，在負(fù)載ACNs的W1/O/W2雙乳液系統(tǒng)中使用酪蛋白作為乳化劑的研究目前鮮見報道。因此，本研究主要目的是：1）以含有聚甘油-聚蓖麻酸酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）的玉米油為油相，酪蛋白鈉溶液為外水相，將葡萄皮粉中提取的ACNs包封在W1/O/W2型乳液中；2）分析雙乳液的形態(tài)和貯存穩(wěn)定性；3）表征體外模擬口腔、胃和腸道消化過程中富含ACNs乳液的微觀結(jié)構(gòu)、粒徑、Zeta電位、靶向輸送和抗氧化活性。該研究擬為食品和醫(yī)藥產(chǎn)品中通過W1/O/W2型微載體系統(tǒng)輸送水溶性生物活性成分并對其進行控釋提供理論支持和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油 市售；葡萄皮粉 加拿大約瑟夫天然產(chǎn)品公司；牛乳酪蛋白鈉鹽、豬胰α-淀粉酶、豬胃蛋白酶、豬胰酶、脂肪酶、豬膽鹽、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸（Trolox）、2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽、1,1-二苯-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、L-抗壞血酸、熒光素、苯甲基磺酰氟美國Sigma Aldrich公司；飛燕草素、矢車菊素、天竺葵色素、錦葵花素 美國Indofine Chemical公司；鹽酸、檸檬酸、苯甲酸鈉 加拿大Sigma Scientific公司；PGPR（4175） 美國Palsgaard公司；氯化鈉、甲醇、異丙醇、甲酸、己烷、乙醇 加拿大Caledon實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

微流化器 加拿大ATS公司；Polytron PT 2500 E勻漿器 瑞士Kinematica AG公司；Amicon-Ultra 15-離心過濾裝置 德國Millipore公司；光學(xué)顯微鏡、AxioCam MRC5照相機 德國Zeiss公司；Zetasizer激光粒度儀英國Malvern儀器公司；ARES-LS1流變儀 美國TA儀器公司；UV微板讀數(shù)器 美國Bio-Tek儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白溶液和葡萄皮提取物的制備

將酪蛋白鈉粉末溶于去離子水中，溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，攪拌約2 h，4 ℃貯存過夜以完全水合。葡萄皮提取物的制備參考文獻[18]。

1.3.2 W1/O/W2型乳液的制備

方法參考文獻[18]。將30 g葡萄皮提取物逐滴添加到70 g油相（包括66 g玉米油和4 g PGPR）中，于10 000 r/min均質(zhì)10 min以制備W1/O初乳。將W1/O初乳（20 g）加入到80 g外水相溶液中，6 000 r/min均質(zhì)5 min。然后，將其在500 bar的壓力下通過微流化器以獲得W1/O/W2復(fù)乳。

1.3.3 模擬體外消化

方法參考文獻[18]。將2 mL蒸餾水加入到2 mL消化物中，渦旋混合。于Amicon-Ultra 15-離心過濾裝置中，6 000 r/min離心30 min，收集濾液用于分析和測定。無樣品的消化液用作對照。

1.3.4 顯微鏡觀察

參考文獻[18]方法。在100 倍油浸物鏡下觀測乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5 乳狀液的穩(wěn)定性

將收集的不同消化步驟的乳狀液轉(zhuǎn)移到試管中，用塑料蓋密封，并在25 ℃保存24 h。數(shù)碼相機拍攝乳狀液的照片。

1.3.6 粒徑和Zata電位的測定

方法參考文獻[19]。將消化后的乳液收集到試管中，并用雙蒸水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。在25 ℃條件下用Zetasizer測量稀釋后乳液的Zata電位和粒徑。

1.3.7 凝膠電泳

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測各種消化條件下蛋白質(zhì)的變化[20]。

1.3.8 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測ACNs

參考文獻[18]方法。在520 nm波長處定量外標(biāo)（即氯化飛燕草素、氯化矢車菊素、氯化天竺葵素和氯化錦葵色素），并基于峰面積建立校準(zhǔn)曲線。

1.3.9 ACNs從W1/O/W2型乳液中的釋放

參考文獻[18]方法。使用2 mL雙蒸水稀釋2 mL W1/O/W2乳液，并使用Amicon-Ultra 15-離心過濾裝置以6 000 r/min離心30 min。收集濾液用于HPLC分析以評估ACNs的包埋率。

1.3.10 抗氧化活性評價

參考文獻[17,21-22]方法。在517 nm波長處，通過分光光度法測定樣品對DPPH自由基清除率；采用485 nm激發(fā)波長和528 nm發(fā)射波長，測定提取物的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量（μmol）；使用可見UV微板讀數(shù)器在593 nm波長處讀取吸光度測定鐵還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP），結(jié)果表示為抗壞血酸當(dāng)量（μmol/L）。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)為3 次獨立實驗結(jié)果的 ±s，采用單因素方差分析比較均值。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 14.0進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 W1/O/W2型乳液的形態(tài)及貯存穩(wěn)定性

圖1 W1/O/W2型乳液的照片F(xiàn)ig. 1 Photographs of W1/O/W2 emulsions

采用W1/O/W2型乳液包封ACNs提取物，并對其形態(tài)和穩(wěn)定性進行評價。圖1a～d表明，W1/O/W2型乳液均勻，表面光滑，未見氣孔或裂紋。顯微鏡分析顯示，許多小液滴位于大液滴的內(nèi)部（圖2a），根據(jù)Florence和Whitehill分類顯示該乳液是B型W1/O/W2多重乳液[23]。乳液在4 ℃保存8 周后仍均勻，無明顯的絮凝、聚結(jié)現(xiàn)象（圖1b～d），液滴呈球形并均勻分散在系統(tǒng)中（圖2f）。貯藏后，Zata電位為（59.53±0.74）mV，與新鮮乳液（58.20±1.04）mV相比無明顯變化，說明W1/O/W2型乳液具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)體外胃腸消化并在4 ℃貯存24 h后，W1/O/W2型乳液出現(xiàn)明顯的相分離現(xiàn)象（圖1g～i），表明乳液由于脂滴的聚集而變得不穩(wěn)定。

圖2 W1/O/W2型乳液體外消化模型的顯微照片（×100）Fig. 2 Photomicrographs of W1/O/W2 emulsions after in vitro digestion (× 100)

2.2 體外模擬消化對W1/O/W2型乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

利用顯微鏡（圖2）和激光衍射（圖3、4）評估體外消化不同階段W1/O/W2型乳液微觀結(jié)構(gòu)變化。初始W1/O/W2型乳液平均粒徑為（149.33±1.44）nm（PDI=0.190±0.024），呈雙峰尺寸分布，粒徑尺寸分布在100～900 nm和3 500～6 500 nm范圍內(nèi)?？谇幌ǖ贗階段）后，粒徑大小保持不變（d=（142.50±3.19） nm），粒徑尺寸分布在90～1 300 nm和2 600～6 500 nm范圍內(nèi)（圖4），表明α-淀粉酶不影響乳液的微觀結(jié)構(gòu)。胃消化（第II階段）后，乳液平均粒徑顯著增加（P＜0.01），這可能歸因于胃蛋白酶對乳化蛋白的消化。在胃消化過程中雙乳液液滴結(jié)構(gòu)塌陷導(dǎo)致W1/O液滴釋放并聚集在一起（圖2c），這可能是相分離的主要原因（圖1g）。然而，F(xiàn)rank[24]、Giroux[25]和Shima[26]等的研究表明雙乳液在人工胃孵育期間是穩(wěn)定的。此外，Xiao Jie等[27]發(fā)現(xiàn)雙乳液結(jié)構(gòu)在胃消化過程中塌陷并釋放大部分內(nèi)部水相。上述研究結(jié)果的不一致與乳化劑或模擬胃條件（如pH值、離子濃度等）的差異有關(guān)。

圖3 W1/O/W2型乳液在不同體外消化階段的平均粒徑Fig. 3 Mean particle diameters of W1/O/W2 double emulsion droplets in different in vitro digestion phases

圖4 W1/O/W2型乳液體外消化前后的粒徑分布Fig. 4 Particle size distribution of W1/O/W2 double emulsions containing ACNs before and after in vitro digestion

當(dāng)乳液從模擬胃進入到腸道消化后，平均粒徑（第III階段d=（130.27±5.57）nm，粒徑范圍在40～650 nm和4 800～6 500 nm之間；第IV階段d=（141.17±8.48）nm）顯著降低（P＜0.05）（圖2d、e和圖3、4）。這可能是由于在胰酶或/和脂肪酶的作用下，W1/O液滴被破壞，內(nèi)部水相被釋放，油相經(jīng)膽鹽進一步乳化形成更小的油滴所致（圖2d、e），這與Frank[24]和Shima[26]等的結(jié)果一致。

2.3 體外模擬消化對W1/O/W2型乳液Zeta電位的影響

研究監(jiān)測了體外消化不同階段乳液電荷（即Zeta電位）的變化情況。結(jié)果表明所有乳液樣品均具有負(fù)Zeta電位。最初的乳液（pH 6.6～6.8）呈現(xiàn)出較強的負(fù)電位（（-58.20±1.04）mV），這主要取決于外部乳化劑（圖5）。模擬口腔消化（pH 6.6～6.8）后乳液的Zeta電位降至（-50.93±0.84）mV，而胃消化（pH 2.0）后乳液Zeta電位的絕對值最?。ǎ?4.36±0.16）mV）。其他研究也報道了在模擬胃液中蛋白質(zhì)包裹脂滴的Zeta電位的類似結(jié)果[19,28-29]。β-酪蛋白容易形成交聯(lián)界面層[30]，但在模擬胃消化過程中，在酶和酸作用下容易降解，解釋了液滴的表面層被部分破壞的原因。而Zeta電位絕對值越小，表明液滴表面所攜帶的電荷越少，液滴越容易聚集在一起，這是胃消化后乳液平均粒徑顯著增加的原因之一。

圖5 體外消化后封裝ACNs的W1/O/W2型乳液的Zeta電位Fig. 5 Zeta potential of W1/O/W2 double emulsions containing ACNs after in vitro digestion

當(dāng)乳液在模擬小腸條件下（pH 6.8）處理時，Zeta電位的絕對值（III期為（59.53±0.26）mV，IV期為（67.50±0.65）mV）甚至高于原乳液。乳液電荷的變化可歸因于：1）溶液的酸堿度和離子強度的變化；2）消化液中的帶電顆粒吸附到乳化劑層上[19,28-29]。此外，本研究中測試的乳液在體外胃和腸道消化過程中比具有相似乳化劑和油相的乳狀液攜帶更多的負(fù)電荷[31]。這可能與消化液的成分和酸堿度、油相的成分以及乳液中內(nèi)部水相的存在有關(guān)。

2.4 體外消化對W1/O/W2型乳液表面蛋白的作用

如圖6所示，經(jīng)α-淀粉酶水解后，蛋白條帶與原雙乳液相比保持不變（圖6I）。胃消化30 min后，蛋白條帶消失，并觀察到一些分子質(zhì)量較低的微弱肽帶（圖6II），這與Andrade等[22]研究結(jié)果一致。乳液經(jīng)胃消化后進入腸道消化2 h，肽段進一步水解形成較小的胰蛋白酶抗性肽（圖6III、IV）。第III、IV階段之間的肽帶沒有差異。SDS-PAGE也證實經(jīng)模擬胃腸消化后，W1/O/W2型乳液的雙層結(jié)構(gòu)已被破壞。

圖6 模擬體外消化后酪蛋白穩(wěn)定雙乳液的SDS-PAGE圖譜Fig. 6 Reducing tricine SDS-PAGE patterns of casein-stabilized double emulsions after in vitro simulated digestion

2.5 體外消化對W1/O/W2乳液ACNs釋放的影響

如圖7所示，W1/O/W2型乳液ACNs包封率為（82.99±2.38）%。經(jīng)口腔消化后，ACNs仍保留在雙乳液的內(nèi)相里，證明α-淀粉酶對乳液的微觀結(jié)構(gòu)沒有破壞作用。相比口腔消化，胃消化后ACNs釋放率（約12%）顯著升高（P＜0.05）。這可能是酶消化過程中，W1/O液滴釋放到外部水相并與周圍水相擴散或聚結(jié)所致[24,32-34]。Shima等[26]的研究表明雙乳液不受人工無酶胃液影響，包封率不變。以上結(jié)果證實添加胃蛋白酶（或其他相關(guān)酶）會破壞乳液結(jié)構(gòu)，隨后導(dǎo)致ACNs的部分釋放。Frank[24]、Oidtmann[35]以及Flores[36]等也報道了類似發(fā)現(xiàn)。然而，Xiao Jie[27]、Andrade[22]等的研究結(jié)果顯示W(wǎng)1/O/W2型乳液的內(nèi)水相（W1）由于液滴結(jié)構(gòu)的崩潰而主要在胃消化階段釋放。

圖7 W1/O/W2型乳液中ACNs的封裝效率Fig. 7 Encapsulation efficiency of ACNs into W1/O/W2 double emulsions

本研究表明乳液經(jīng)腸道消化后ACNs釋放率達(dá)到最大（第III階段為（39.87±4.57）%，第IV階段為（43.89±3.84）%）。主要原因可能是經(jīng)胰蛋白酶或/和脂肪酶消化后W1/O液滴的油層被水解導(dǎo)致釋放出ACNs。本實驗結(jié)果與Frank[24]、Flores[37]、Gir o u x[25]和S him a[26]等研究結(jié)果一致。相以，Aditya等[38]報道體外無酶腸道消化1 h內(nèi)，超過45%的姜黃素從W1/O/W2型乳液中釋放。這種差異可能與人工消化液的化學(xué)成分、封裝方法、壁材類型或內(nèi)部水相的理化性質(zhì)有關(guān)[22]。值得注意的是，HPLC法測定的ACNs釋放率可能低于實際值。其原因可能是：1）ACNs與肽的相互作用[39]；2）釋放的ACNs在小腸條件下不穩(wěn)定，降解速度更快[40]。

2.6 體外消化對W1/O/W2型乳液抗氧化活性的影響

如圖8所示，經(jīng)口腔消化后，乳液的DPPH自由基清除率、ORAC和FRAP值無明顯變化，而在體外胃腸消化后，其抗氧化活性顯著提高（P＜0.05）。胃消化后仍有（70.53±5.31）%的ACNs滯留在油滴中。然而，與原乳液和經(jīng)口腔消化后的乳液相比，此時的乳液具有更高的抗氧化活性（P＜0.05）。其主要原因可能是由于ACNs分子具有親水性，使得其很容易擴散到親水性介質(zhì)中[38]。此外，胃腸酶水解酪蛋白產(chǎn)生的抗氧化肽可能也會增加乳液的抗氧化活性[41]。經(jīng)胰酶或脂肪酶模擬腸道消化后，抗氧化活性最高，這可以用乳液釋放出最高量的ACNs解釋。Ydjedd等[42]的研究結(jié)果也表明在腸道消化過程中，從乳液中釋放出的酚類和類黃酮含量最高。本實驗結(jié)果與Flores[36-37]、Betz[43]和Oidtmann[35]等研究結(jié)果一致，表明微膠囊能夠在模擬胃腸消化過程中穩(wěn)定ACNs并維持高抗氧化活性。相以，Cofrades等[44]研究表明，由于生物活性化合物的損失，體外胃腸消化顯著降低了雙乳液和凝膠雙乳液的抗氧化活性。

圖8 采用DPPH、ORAC和FRAP法測定封裝ACNs的W1/O/W2型乳液體外消化前后的抗氧化活性Fig. 8 Antioxidant activities of W1/O/W2 micro-emulsions containing ACNs evaluated by DPPH, ORAC and FRAP assays before and after in vitro digestion

3 結(jié) 論

本研究以W1/O/W2型乳液封裝ACNs提取物，該體系具有較高的包封率（82.99±2.38）%和較好的貯存穩(wěn)定性。原W1/O/W2型乳液的平均粒徑為（149.33±1.44）nm，經(jīng)口腔消化后，平均粒徑保持不變。與其他體外消化階段相比，胃消化后乳液的平均粒徑顯著增加（P＜0.05），所帶電荷量最低（Zeta電位為（-4.36±0.16）mV）。模擬腸道消化后平均粒徑顯著減?。≒＜0.05），Zeta電位絕對值為（-67.50±0.65）mV達(dá)最高。顯微結(jié)構(gòu)圖片、SDS-PAGE、包埋率和抗氧化活性的結(jié)果證實，模擬胃消化可以破壞雙乳液的雙層結(jié)構(gòu)，釋放出較小的W1/O液滴并聚集在一起形成較大的顆粒，ACNs主要保留在W1相中。在腸道消化過程中（第III、IV階段），油相水解進一步破壞了W1/O液滴的結(jié)構(gòu)，檢測到ACNs最高釋放量和抗氧化活性。結(jié)果顯示W(wǎng)1/O/W2型乳液可以有效地保護ACNs免受模擬口腔和胃消化的影響，證明它是控制食品和醫(yī)藥產(chǎn)品中生物活性化合物釋放的有應(yīng)用潛力的微型載體系統(tǒng)。