蜀葵-膠質(zhì)芽孢桿菌聯(lián)合修復(fù)土壤鎘污染

趙 胤，龍 月，潘遠(yuǎn)智，茍 靜，吳騫里，周 蛟，鄔夢(mèng)晞，劉柿良

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都 611130）

重金屬鎘（Cd）由于交通運(yùn)輸、工業(yè)排放、大氣沉降等活動(dòng)在土壤中不斷積累，對(duì)城市環(huán)境質(zhì)量與居民身心健康造成潛在危害[1]。利用植物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行土壤重金屬污染的治理，擁有良好的發(fā)展前景。但如何提高植物的重金屬修復(fù)效率，是近年來(lái)相關(guān)研究關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[2]。研究表明，土壤微生物可以通過(guò)分泌鐵載體[3]、有機(jī)酸[4]、表面活性劑[5]等活性物質(zhì)改變重金屬在土壤中的形態(tài)，增加植物對(duì)重金屬的耐性與吸收，同時(shí)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物修復(fù)重金屬效率[6-7]。因此，微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)成為強(qiáng)化植物重金屬修復(fù)的重要手段之一。

膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）作為一種根際促生菌，廣泛應(yīng)用于微生物肥料、礦物分解和生物絮凝等方面[8]。研究表明，膠質(zhì)芽孢桿菌可以促進(jìn)印度芥菜（Brassica juncea）的生長(zhǎng)并提高其Cd 吸收量[9]；提高Brassica juncea對(duì)土壤中 Pb、Zn、Cu 的富集吸收能力[10]；提高土壤酶活性[11]。蜀葵（Althaea rosea）為錦葵科蜀葵屬園林觀賞植物，具有生物量大、根系發(fā)達(dá)和適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)[12]。研究表明蜀葵對(duì)重金屬Cd、Pb 具有較強(qiáng)的耐受性[13-14]，同時(shí)施用外源物質(zhì)可以促進(jìn)蜀葵對(duì)Cd 的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)，使得蜀葵有潛力成為Cd 超富集植物[15]。但目前圍繞蜀葵進(jìn)行微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤的研究尚不多見(jiàn)。本研究以蜀葵為試驗(yàn)植物，采用土壤盆栽試驗(yàn)，探討蜀葵-膠質(zhì)芽孢桿菌聯(lián)合修復(fù)Cd 污染土壤的能力，以期為土壤Cd污染的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用土壤采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)周邊0～20 cm 的表層田園土，將其置于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干、輾碎，過(guò)4 mm篩混勻備用。土壤理化性質(zhì)如下：速效氮18.9 mg·kg-1、速效磷64.5 mg·kg-1、速效鉀55.2 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量 21 g·kg-1，Cd 含量 0.06 mg·kg-1，pH 6.8。

蜀葵種子購(gòu)于藍(lán)翔園藝種苗有限責(zé)任公司，挑選大小一致、飽滿的種子經(jīng)5%NaClO 溶液消毒30 min，去離子水洗凈。播種于裝滿蛭石的穴盤(pán)內(nèi)，澆透水后置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至4～5片葉，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗作為供試苗。膠質(zhì)芽孢桿菌購(gòu)買(mǎi)自山東綠隴生物公司（芽孢數(shù)≥50×108CFU·g-1）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于 2017年9 月底至 2018年1 月初在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院設(shè)施大棚內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置土壤Cd 濃度為25 mg·kg-1，共5 個(gè)處理（表1），每個(gè)處理3 次重復(fù)。將 Cd 以分析純 CdCl2·2.5H2O 固體粉末態(tài)與供試土壤充分混勻，裝入塑料花盆（上緣直徑22 cm，底面直徑16 cm，高25 cm）中。每盆裝土3 kg（以風(fēng)干土計(jì)），靜置平衡30 d。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design

土壤平衡結(jié)束后進(jìn)行膠質(zhì)芽孢桿菌接種。接種方式為暗光條件下，分別稱取9、18、27 g 膠質(zhì)芽孢桿菌粉劑，按3、6、9 g·kg-1的處理濃度與每盆土壤充分拌勻。裝盆時(shí)采用根袋法區(qū)分根際土壤和非根際土壤。每個(gè)根袋內(nèi)裝土300 g 放在花盆中間位置，根袋周?chē)猛撂顫M，保持根袋內(nèi)外裝土高度一致且根袋高于土面2 cm。用超純水澆透后再用黑色塑料袋套住盆面，靜置10 d。期間始終保持根袋內(nèi)外土壤濕度一致，含水量為田間持水量的60%。靜置后移栽蜀葵幼苗，每盆種植3 株。處理期間采用超純水進(jìn)行水分管理，不額外施肥，處理70 d。

1.3 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.3.1 生物量的測(cè)定

處理70 d后將植株從盆中取出，用超純水沖洗干凈，各植株樣品分根、莖和葉3 部分，用電子天平稱量各部分鮮質(zhì)量。之后分裝置于80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量各部分干質(zhì)量。

1.3.2 植物與土壤樣品Cd含量的測(cè)定

脅迫處理結(jié)束后，將根袋小心取出，采用抖落法收集根際土壤。將干燥的植物樣品與土壤樣品研磨至通過(guò)2 mm 篩，土壤樣品采用HNO3-HCl-HClO4法消化（V∶V∶V=1∶1∶2），植物樣品采用HNO3-HClO4法消化（V∶V=5∶1）。待測(cè)液用AA-700 原子吸收分光光度計(jì)（島津，日本）測(cè)定Cd 含量，測(cè)定波長(zhǎng)為228.8 nm。土壤有效態(tài)Cd的測(cè)定參照Lindsay等[16]采用DT?PA（pH 7.3）浸提法。

1.3.3 土壤酶活性的測(cè)定

土壤相關(guān)酶活性測(cè)定參照關(guān)松蔭[17]的方法：土壤脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，以24 h每克土壤產(chǎn)生NH3-N 的毫克量為單位；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，活性以24 h每克土壤產(chǎn)生葡萄糖的毫克量為單位；土壤脫氫酶活性采用三苯基四氮唑氯化物比色法測(cè)定，以24 h每克土壤產(chǎn)生三苯基甲臜的微克量為單位；土壤多酚氧化酶采用鄰苯三酚比色法測(cè)定，活性以2 h 每克土壤生成的紫色沒(méi)食子酸毫克量為單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Excel 2010 統(tǒng)計(jì)軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖，SPSS 24.0 軟件用于分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan 法進(jìn)行多重比較，Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析（雙尾檢驗(yàn)）。

生物富集系數(shù)（BCF）=植物體內(nèi)Cd 含量/土壤中Cd含量

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=地上部Cd含量/地下部Cd含量

2 結(jié)果與分析

2.1 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，與CK 組相比，Cd 處理造成蜀葵根、莖、葉及總生物量降低，但在Cd脅迫下施用不同濃度菌肥可提高蜀葵根冠比。相比于C1 處理，C1J2 處理下蜀葵根、莖與總生物量顯著提高（P＜0.05），C1J3 處理下蜀葵根冠比顯著提高（P＜0.05）。

2.2 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)蜀葵各器官Cd吸收能力的影響

由圖1 可知，Cd 脅迫下，C1J2 處理顯著提高蜀葵根、莖 Cd 含量（P＜0.05），C1J1 和 C1J3 處理下，蜀葵根、莖Cd含量未發(fā)生顯著變化；施用菌肥未對(duì)蜀葵葉片Cd 含量產(chǎn)生影響。圖2 顯示，Cd 脅迫下施用不同濃度菌肥，蜀葵各部位Cd 積累量顯著提高（P＜0.05），且在C1J2處理下，蜀葵整株Cd積累量相較于C1處理提高189%。

表3 顯示，Cd 脅迫下施用不同濃度菌肥，均可顯著提高蜀葵對(duì)重金屬Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（P＜0.05）。且與C1 處理相比，C1J2 處理顯著提高了蜀葵Cd 生物富集系數(shù)（P＜0.05），C1J1 和C1J3 處理下蜀葵Cd 富集系數(shù)無(wú)顯著變化。

圖1 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵Cd含量的影響Figure 1 Effects of Bacillus mucilaginosus on cadmium content of Althaea rosea under cadmium stress

圖2 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵Cd積累量的影響Figure 2 Effects of Bacillus mucilaginosus on cadmium accumulation in Althaea rosea under cadmium stress

表2 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵干質(zhì)量的影響Table 2 Effects of Bacillus mucilaginosus on dry weight of Althaea rosea under cadmium stress

2.3 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵根際土壤Cd形態(tài)的影響

由表4可知，與C1處理相比，施用菌肥后，蜀葵根際土壤總Cd含量下降，且C1J2處理下總Cd含量顯著降低（P＜0.05）。施用菌肥后，根際土壤有效態(tài)Cd含量相比C1 處理均顯著上升（P＜0.05），其中C1J2 處理下有效態(tài)Cd含量相比C1處理提高了13%，達(dá)到峰值。

2.4 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd 脅迫下蜀葵根際土壤酶活性的影響

由圖3可知，與CK組相比，C1處理下蜀葵根際土壤中脲酶、蔗糖酶、脫氫酶活性均顯著減弱（P＜0.05），而多酚氧化酶活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。Cd 脅迫下，隨著菌肥施用濃度的上升，根際土壤中脲酶、蔗糖酶、脫氫酶活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而多酚氧化酶活性減弱且差異顯著（P＜0.05）。

由表5 分析可得，蜀葵Cd 積累量與根際土壤中脲酶活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與蔗糖酶活性呈正相關(guān)，與脫氫酶活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），但與多酚氧化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。綜合表明，蜀葵根際土壤中脲酶、脫氫酶和多酚氧化酶活性對(duì)蜀葵的Cd積累量影響能力強(qiáng)，蔗糖酶活性影響力弱。

3 討論

植物生物量是研究逆境脅迫的常用指標(biāo)，是植株生長(zhǎng)狀態(tài)的綜合體現(xiàn)。研究表明，在重金屬脅迫下，接種微生物可促進(jìn)植物生長(zhǎng)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cd脅迫下施用不同濃度膠質(zhì)芽孢桿菌促進(jìn)了蜀葵的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為蜀葵根、莖生物量與根冠比提高。這與Li等[19]、張宇羽等[20]報(bào)道的結(jié)果一致，原因在于芽孢桿菌分泌的如吲哚乙酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素等胞外代謝產(chǎn)物[21-22]可以刺激根系擴(kuò)張及不定根、側(cè)根的發(fā)育[23]，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。同時(shí)，膠質(zhì)芽孢桿菌胞外產(chǎn)生的莢膜多糖具有一定的生理活性，可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[24]，提高土壤肥力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

生物富集系數(shù)與轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)可評(píng)估植物對(duì)重金屬的吸附效率，富集系數(shù)可評(píng)價(jià)植物吸收土壤中重金屬能力的高低，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)可反映植物對(duì)重金屬?gòu)牡叵虏哭D(zhuǎn)移到地上部能力的大小[25]。微生物可通過(guò)自身代謝產(chǎn)生的分泌物活化、絡(luò)合土壤中的Cd，從而改變土壤Cd 有效性，影響植物對(duì)Cd 的富集及轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。本試驗(yàn)中，施用6 g·kg-1膠質(zhì)芽孢桿菌顯著提高了蜀葵根、莖Cd 含量與植株Cd 積累量。這與Luo 等[27]、趙樹(shù)民等[28]試驗(yàn)結(jié)果一致，原因在于根際土壤中有效態(tài)Cd含量的顯著上升。而當(dāng)菌肥施用濃度達(dá)到9 g·kg-1時(shí)，過(guò)高濃度的膠質(zhì)芽孢桿菌與蜀葵開(kāi)始競(jìng)爭(zhēng)土壤養(yǎng)分，導(dǎo)致蜀葵生物量下降，進(jìn)一步影響了整株Cd積累量。同時(shí)，與本試驗(yàn)結(jié)果不同的是，王小敏等[29]研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)芽孢桿菌在短期和長(zhǎng)期的恒溫培養(yǎng)下，對(duì)土壤DTPA 提取態(tài)Cd 含量無(wú)顯著影響或有一定的鈍化作用。產(chǎn)生結(jié)果相異的原因可能在于即使相同的芽孢桿菌菌株在不同培養(yǎng)條件下代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸種類與數(shù)量也不相同，而且有機(jī)酸與重金屬的絡(luò)合作用也受土壤中復(fù)雜環(huán)境所影響[30]。

表3 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵Cd富集系數(shù)、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響Table 3 Effects of Bacillus mucilaginosus on cadmium enrichment coefficient and transport coefficient of Althaea rosea under cadmium stress

表4 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵根際土壤總Cd及有效態(tài)Cd含量的影響Table 4 Effects of Bacillus mucilaginosus on total cadmium and available cadmium in rhizosphere soil of Althaea rosea under cadmium stress

圖3 膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)Cd脅迫下蜀葵根際土壤酶活性的影響Figure 3 Effects of Bacillus mucilaginosus on activities of soil enzymes in rhizosphere of Althaea rosea under cadmium stress

表5 蜀葵根際土壤酶活性與蜀葵Cd積累量間的相關(guān)性（n=12）Table 5 Correlation between soil enzymes activity and cadmium accumulation in rhizosphere of Althaea rosea（n=12）

土壤酶作為土壤中穩(wěn)定的具有特殊催化能力的一類蛋白質(zhì)，在反映土壤生態(tài)系統(tǒng)變化[31]等方面起著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cd 處理降低了土壤脲酶與蔗糖酶的活性，說(shuō)明對(duì)土壤脲酶和蔗糖酶有明顯的抑制作用，可能是由于Cd與酶的活性位置結(jié)合，與底物產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制[32]。而隨著膠質(zhì)芽孢桿菌施加濃度的上升，土壤脲酶和蔗糖酶的活性也不斷增強(qiáng)，表明Cd污染下土壤中的氮、碳的養(yǎng)分循環(huán)狀況得到有效緩解并好轉(zhuǎn)[33-34]。這一結(jié)果與常文智等[11]的研究結(jié)果一致，原因可能在于膠質(zhì)芽孢桿菌在代謝過(guò)程中分泌大量的多糖等物質(zhì)可分解土壤中難溶性礦物，為土壤微生物提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[35]。本試驗(yàn)中，施用膠質(zhì)芽孢桿菌可顯著提高土壤脫氫酶的活性，表明施用菌肥后蜀葵根際土壤微生物新陳代謝的整體活性不斷增強(qiáng)[36]。土壤多酚氧化酶參與土壤中芳香族化合物的物質(zhì)循環(huán)，多用于土壤環(huán)境修復(fù)[37]。本試驗(yàn)中與其他土壤酶不同的是，Cd 脅迫后蜀葵根際土壤多酚氧化酶活性顯著增強(qiáng)，這與Sharma 等[38]、劉耀明等[39]的研究報(bào)道一致?？赡苁且?yàn)镃d2+能夠促進(jìn)底物與多酚氧化酶活性中心的親和作用而產(chǎn)生激活效應(yīng)，同時(shí)Cd2+電子云排布中的空軌道能與酶分子的-OH、-COOH 和-NH2等基團(tuán)形成配位作用，導(dǎo)致酶活力有所增加[40]。研究表明，土壤脲酶活性高時(shí)，可能發(fā)生氮飽和，從而影響多酚氧化酶的活性[41]，這可能是本試驗(yàn)中施用菌肥導(dǎo)致土壤多酚氧化酶活性下降的原因。在土壤這個(gè)復(fù)雜的環(huán)境體系中，土壤酶活性的變化受到多方面的綜合影響。因此，對(duì)于施用膠質(zhì)芽孢桿菌后的作用機(jī)制和內(nèi)在機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

（1）25 mg·kg-1Cd 處理下，施用6 g·kg-1的膠質(zhì)芽孢桿菌可促進(jìn)蜀葵生長(zhǎng)發(fā)育，提高蜀葵的根際土壤有效態(tài)Cd 含量、Cd 積累量與Cd 富集系數(shù)，增強(qiáng)了蜀葵對(duì)Cd污染土壤的修復(fù)效果。今后可通過(guò)細(xì)胞與分子水平的研究進(jìn)一步闡明膠質(zhì)芽孢桿菌促進(jìn)蜀葵Cd富集的機(jī)制。

（2）施用 6 g·kg-1膠質(zhì)芽孢桿菌可提高 25 mg·kg-1Cd 污染土壤下蜀葵根際土壤中脲酶、蔗糖酶與脫氫酶的活性，表明蜀葵根際土壤微生物活性得到增強(qiáng)，氮、碳的養(yǎng)分循環(huán)有所改善。施用3～9 g·kg-1膠質(zhì)芽孢桿菌可引起蜀葵根際土壤多酚氧化酶活性的下降。

（3）蜀葵-膠質(zhì)芽孢桿菌聯(lián)合體系可以提高蜀葵修復(fù)Cd 污染土壤的能力。同時(shí)，蜀葵因其觀賞價(jià)值高、生物量大和適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可在修復(fù)Cd污染土壤的同時(shí)美化環(huán)境。因此，在城市綠地土壤與工礦廢棄地等區(qū)域，該聯(lián)合修復(fù)體系在Cd 污染土壤修復(fù)中具有一定的應(yīng)用潛力和價(jià)值。