黃腐酸鉀對植煙土壤氮素轉化及N2O排放的影響

李青山，王德權，高政緒，杜傳印，管恩森，程 誼，王慎強

（1.土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；2.中國科學院大學，北京 100049；3.山東濰坊煙草有限公司，山東 濰坊 261205；4.南京師范大學地理科學學院，江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210023）

我國是農業(yè)大國，煙草作為我國的重要經濟作物，煙葉生產量及成品煙銷售量已占世界的1/3左右。根據2012 年煙草專賣局官方統(tǒng)計，我國煙葉種植面積已達到3300 萬hm2。而與先進烤煙生產國相比較（如津巴布韋和美國），我國煙葉的內外在品質仍存在差距，表現(xiàn)在整體香氣量不足，上部煙葉煙堿含量較高和葉片過厚等方面[1]。在烤煙生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素中，氮素是影響煙葉產量和品質最為重要的營養(yǎng)元素[2]，氮素不足或過量都會導致煙葉產量和品質的下降[3]。巨曉棠等[4]研究表明，我國烤煙在打頂后仍吸收大量氮素，且這部分氮素主要來自土壤氮，這與國外生產優(yōu)質烤煙的吸氮曲線有很大差異。有研究表明，我國80%以上的植煙土壤中有機質含量高于25 g·kg-1[5]，這意味著土壤氮在合適條件下會釋放大量氮素，尤其在烤煙生長發(fā)育后期多是在高溫多雨的氣候條件下。另外，李春儉等[1]研究也表明，我國部分植煙區(qū)的烤煙在打頂后仍大量吸收氮素，是導致我國上部煙葉整體質量得不到提升的重要原因。因此，通過采取合適的措施來調控烤煙生長后期土壤氮素供應是獲得優(yōu)質烤煙煙葉的關鍵[6-7]。

硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是烤煙能夠利用的主要有效氮源，施入土壤中的氮素受微生物作用進行轉化分配，其轉化程度除受土壤質地、溫度、水分、pH、有機質和含氮量等諸多因子的影響外[8-9]，還受外源物質尤其是有機質的影響，這是由于有機物質可向微生物提供可利用的碳源和能源[10]。向土壤中添加不同來源和不同質量的外源碳對土壤氮素轉化具有重要影響[11-13]，所得出的結果由于添加碳源的性質不同及土壤本身的差異而有所不同，表現(xiàn)為促進或抑制了土壤氮的凈礦化[14-16]。添加外源有機質后土壤氮素有效性取決于其C/N，添加低C/N 的有機質（C/N＜20）表現(xiàn)為氮素的凈礦化[17]；而添加高C/N 的有機質則導致微生物對氮素的凈固持[18]。因此，微生物同化作用在調節(jié)土壤中有效氮含量方面起著重要的作用[19]。已有研究報道，異養(yǎng)微生物能夠被可利用的碳源刺激而促進微生物同化作用[20-21]。幾項研究表明，蔗糖、鋸末或稻草的施用均能降低草地、草原和山艾樹生態(tài)系統(tǒng)恢復時的土壤氮素有效性[22-23]。巨曉棠等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，添加小麥秸稈（高C/N）顯著降低了土壤中無機氮含量；而添加苜蓿秸稈或雞糞（低C/N）則顯著提高土壤中無機氮含量。

另有研究表明，添加外源碳影響了微生物對不同形態(tài)氮的吸收同化，因此對不同肥力水平土壤的氮素轉化產生顯著影響[12-13]。例如，長期受微生物優(yōu)先利用-N 這一傳統(tǒng)觀點的影響，人們普遍認為農田土壤微生物不利用-N[25-26]；但向土壤中添加作物殘茬和收獲后殘留物，由于增加了土壤中有效碳含量，-N的微生物同化量得到提高[27-28]。在一項Me?ta分析中，Cheng等[29]也發(fā)現(xiàn)當葡萄糖和醋酸鹽的添加量≥500 mg C·kg-1土或者動物糞肥和植物秸稈的C/N＞18時，均會促進微生物對-N的同化。

添加外源碳會影響土壤氮素的礦化作用和硝化作用，同時也會對反硝化過程產生影響[30]。N2O 主要來自土壤中氮素硝化和反硝化兩個過程。由于土壤中好氣和厭氣微區(qū)同時存在，因此兩個過程可能同時發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)反應底物（氮源、碳源）的有效性是影響硝化和反硝化作用的重要因素之一。添加外源碳對土壤有機碳的轉化過程產生重要影響，進而直接影響到土壤的碳固定和溫室氣體排放[31]。另外，Morley等[32]研究表明，土壤有機質為絕大多數異養(yǎng)微生物提供了碳源和電子供體，并為土壤呼吸作用提供基質。因此，土壤有機質是調控N2O 排放的重要因子。另有研究表明，添加碳源能夠增強土壤呼吸強度并顯著增加土壤微生物量，但不同外源碳成分及濃度導致溫室氣體排放的多少也有差異[33-34]。

腐植酸是土壤有機質的主要成分，它是由動植物殘體經化學反應和微生物分解形成的大分子有機酸[35]。腐植酸無毒、無公害，在農業(yè)生產中具有改良土壤、增進肥效、刺激生長、促進抗逆、改善品質等5大作用[36]。黃腐酸鉀作為腐植酸類肥料的一種，具有短碳鏈分子結構和可溶性較強的特點。研究表明，氮肥配施黃腐酸鉀均能提高作物產量和肥料利用率[37-38]。然而，黃腐酸鉀作為一種高C/N 的可溶性碳源，向土壤中添加黃腐酸鉀對于氮素轉化的影響如何？另外，在烤煙生長后期向土壤中添加黃腐酸鉀是否可以作為一種調控植煙土壤后期氮素供應過多的措施？這些問題值得我們探究。因此本文擬先采用室內培養(yǎng)的實驗方法，通過添加硝酸銨模擬植煙土壤后期含有大量有效氮的情景，探究添加不同量黃腐酸鉀對植煙土壤氮素轉化及N2O 排放的影響，為下一步田間工作提供數據支撐。這對明確添加黃腐酸鉀后氮素的轉化規(guī)律具有重要意義，同時也可為烤煙或其他作物生產中合理施用黃腐酸鉀提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與材料

供試土壤取自山東沂水縣煙草實驗站（118.63°E，35.85°N）內煙田0～20 cm 表層。實驗站位于魯中南丘陵區(qū)，海拔191 m，屬暖溫帶大陸性季風氣候，年均氣溫14.1 ℃，降水量849 mm，蒸發(fā)量約為560 mm，無霜期200 d 以上，土壤類型為褐土（簡育干潤雛形土）。供試土壤的基本理化性質為：可溶性全氮18.48 mg·kg-1，硝態(tài)氮 7.58 mg·kg-1，銨態(tài)氮 4.68 mg·kg-1，可溶性有機氮 6.22 mg·kg-1，全氮 0.76 g·kg-1，有機碳 5.10 g·kg-1，C/N 11.55，pH 6.94。供試土壤多點采集混合后，挑出肉眼可見的植物殘體和石塊，過2 mm篩后保存于4 ℃冰箱。

黃腐酸鉀由上海芳甸生物科技有限公司提供（全氮 2.04 g·kg-1，全碳 440.71 g·kg-1，以干基計），C/N 218.08。分別快速稱取 4.17、8.33、16.77 g 和33.54 g 黃腐酸鉀溶于250 mL 去離子水中，然后在超聲波振蕩器內振蕩30 min，使其溶解均勻，配成4 種不同濃度的黃腐酸鉀溶液：0.83，1.67，3.33 g·mL-1和5 g·mL-1。

1.2 實驗設計

試驗共設置5個處理（：1）對照（CK）：只添加硝酸銨（含-N 和-N 各 100 mg·kg-1，下同）；（2）T1：硝酸銨+2.5 g·kg-1黃腐酸鉀；（3）T2：硝酸銨+5 g·kg-1黃腐酸鉀（；4）T3：硝酸銨+10 g·kg-1黃腐酸鉀（；5）T4：硝酸銨+15 g·kg-1黃腐酸鉀。稱取相當于20 g 干土質量的新鮮土樣于250 mL 玻璃瓶中，培養(yǎng)開始前把土壤混勻，使其厚度均勻地平鋪在瓶底，放在25 ℃室內預培養(yǎng)1 d。預培養(yǎng)結束后，用移液管向每個玻璃瓶中添加3 mL 不同濃度的黃腐酸鉀溶液，使黃腐酸鉀添加量分別為2.5、5、10 g·kg-1和15 g·kg-1，CK 處理則添加3 mL 去離子水；同時向每個玻璃瓶中加3 mL NH4NO3溶液（200 mg·kg-1），含-N 和-N 各100 mg·kg-1。所有添加溶液均用移液管均勻滴入，使其盡可能均勻分布于土壤中，此時土壤含水量為最大田間持水量的67%。然后用硅膠塞將玻璃瓶密封，繼續(xù)在25 ℃下恒溫培養(yǎng)30 d，每隔2 d去塞通氣0.5 h左右，每2～3 d補水1次以補充因蒸發(fā)導致的水分損失。分別在添加氮肥和黃腐酸鉀后第1、3、5、7、14、30 d采集氣體樣品，采集氣體樣品之前，需要提前6 h進行換氣密封。換氣前用南京大學研制的704 硅橡膠將塞與瓶口縫隙密封，待硅膠干燥后，用真空泵抽取玻璃瓶中的氣體3 min，接著通入新鮮空氣，使玻璃瓶中的氣體與外界的氣體平衡，再次進行上述操作，如此反復3 次，確保玻璃瓶中充滿新鮮空氣。在最后一次通入空氣時，采集此時的空氣于20 mL 真空瓶中，作為初始氣體濃度，記錄采樣時間。密封培養(yǎng)6 h之后，從每組處理中隨機取出3 個土壤樣品作為重復，用注射器快速反復抽提5 次以確保玻璃瓶內氣體充分混勻，用帶有三通閥的注射器立即采集20 mL 氣體，注入20 mL的真空瓶中用于測定N2O和CO2的濃度。

分別在培養(yǎng)過程中的第1、3、7、14、30 d，從每組處理中隨機取出3個土壤樣品作為重復，按水土比5∶1向玻璃瓶中加入 100 mL 2 mol·L-1KCl 溶液，振蕩，過濾，收集濾液于塑料瓶中，并于4 ℃下低溫保存，用于測定土壤中可溶性全氮（DTN）、-N 和-N濃度。

1.3 測定項目與方法

土壤KCl 溶液提取后的濾液用Skalar 連續(xù)流動分析儀測定DTN、-N 和-N 濃度 ；N2O 和 CO2的濃度采用氣相色譜儀（Agilent Technologies7890A）測定。土壤pH用電位法（KCl浸提液）測定。

1.4 數據分析處理

凈礦化速率按照公式（1）進行計算：

凈硝化速率按照公式（2）進行計算：

式中：F為氣體的排放速率（N2O，μg N·kg-1·d-1；CO2，mg C·kg-1·d-1）；ρ為標準狀況下 CO2和 N2O 的密度（N2O-N，kg·m-3；CO2-C，kg·m-3）；dc/dt為單位時間內玻璃瓶內氣體濃度增加量，mg·L-1·d-1；V為玻璃瓶中氣體的有效空間體積，mL；T為培養(yǎng)溫度，℃；W為干土的質量，kg。兩次排放通量測定間隔時間內的N2O和CO2排放量用兩次測定的平均排放通量乘以時間間隔計算。整個培養(yǎng)過程中的N2O 和CO2總的排放量則為N2O和CO2累積排放量。

結果中的可溶性氮組分、N2O 和CO2排放數據均為3 次重復數據。采用SPSS 24.0 軟件對數據進行單因素方差分析，用LSD 方法（P＜0.05）分析處理間平均數的差異顯著性，用OriginPro 2018 進行作圖和線性擬合。

2 結果與分析

2.1 可溶性氮

圖1 添加黃腐酸鉀對土壤銨態(tài)氮（A）、硝態(tài)氮（B）、無機氮（C）和可溶性有機氮（D）含量的影響Figure 1 Effects of fulvic acid potassium addition on the concentrations of ammonium nitrogen（A），nitrate nitrogen（B），inorganic nitrogen（C）and soluble organic nitrogen（D）in soil

圖2B 為各處理的凈硝化速率，添加黃腐酸鉀處理的凈硝化速率顯著低于CK 處理（P＜0.05）。T1、T2、T3、T4 處理的凈硝化速率分別為 2.25、1.87、0.37 mg·kg-1·d-1和-1.31 mg·kg-1·d-1，而 CK 處理的凈硝化速率為3.53 mg·kg-1·d-1。可見，添加黃腐酸鉀顯著降低了土壤凈硝化速率，且降低程度也隨黃腐酸鉀添加量的增加而增大。

2.1.3 無機氮（DIN）

2.1.4 可溶性有機氮（DON）

由圖1D 可以看出，添加黃腐酸鉀可以不同程度地提高土壤 DON 含量。與 CK 處理相比 ，T1 和 T2 處理在前7 d 內降低了土壤DON 含量，隨后又提高了土壤DON 含量；T3 處理僅在培養(yǎng)開始和結束時顯著提高了土壤DON 含量；而T4 處理在整個培養(yǎng)過程中均顯著提高了土壤DON 含量。在培養(yǎng)結束時，T1、T2、T3、T4 處理分別比 CK 處理增加了 1.24、1.11、3.88 mg·kg-1和 7.46 mg·kg-1?？梢?，當黃腐酸鉀的添加量≥10 g·kg-1時，可顯著提高DON含量（P＜0.05）。

2.2 N2O和CO2排放量

圖3A為各處理土壤呼吸速率的變化趨勢?？梢钥闯?，添加黃腐酸鉀明顯提高了土壤呼吸速率。T1和T2處理的呼吸速率在前3 d內達到最大值，分別為66.67 mg C·kg-1·d-1和 117.72 mg C·kg-1·d-1；而 T3 和T4 處理的呼吸速率在第1 d 就達到最大值，分別為252.16 mg C·kg-1·d-1和 400.09 mg C·kg-1·d-1，說明呼吸速率達到最大值的時間隨黃腐酸鉀添加量的增加而縮短。T1、T2、T3、T4 處理的呼吸速率達到最大值后均呈現(xiàn)不斷減小的趨勢。CK處理的呼吸速率變化范圍為11.75～26.43 mg C·kg-1·d-1，在整個培養(yǎng)過程中均顯著小于添加黃腐酸鉀處理的呼吸速率（P＜0.05）。另外，由圖4A 可以看出，T1、T2、T3、T4 處理顯著提高了土壤CO2累積排放量（P＜0.05），分別比CK 處理提高了738.11、1 138.86、1 930.33 mg C·kg-1和2 597.92 mg C·kg-1。

圖3B 為各處理N2O 排放速率的變化趨勢。T1、T2、T3、T4 處理的 N2O 排放速率在前 3 d 內達到最大值，分別為 2 448.22、3 512.57、7 259.92 μg N·kg-1·d-1和7 393.66 μg N·kg-1·d-1，之后均呈不斷減小的趨勢。在培養(yǎng)結束時，T1、T2、T3、T4 處理的N2O 排放速率分別降至 1.14、0、0、0 μg N·kg-1·d-1。CK 處理的 N2O 排放速率在整個培養(yǎng)過程中均顯著小于添加黃腐酸鉀處理（P＜0.05），變化范圍為 0～27.04 μg N·kg-1·d-1。可見，添加黃腐酸鉀顯著提高了N2O 排放速率（P＜0.05），且N2O 排放速率隨黃腐酸鉀添加量的增加而增大。另外，添加黃腐酸鉀處理較CK處理顯著增加了N2O 累積排放量（P＜0.05，圖4B），且添加黃腐酸鉀處理間差異顯著。

圖2 配施黃腐酸鉀對土壤凈礦化速率（A）和凈硝化速率（B）的影響Figure 2 Effects of application of fulvic acid potassium on soil net mineralization rate（A）and net nitrification rate（B）

通過對CO2累積排放量和N2O 累積排放量進行線性擬合發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著正相關關系（R2=0.97，P＜0.001），線性關系為y=-0.01x-8.95（圖5A）。另外對凈硝化速率與N2O 累積排放量進行線性擬合發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著負相關關系（R2=0.92，P＜0.001），線性關系為y=-6.26+22.46（圖5B）。

3 討論

圖3 添加黃腐酸鉀對CO（2A）和N2O（B）排放速率的影響Figure 3 Effects of fulvic acid potassium addition on CO（2A）and N2O（B）emission rates

圖4 添加黃腐酸鉀對CO（2A）和N2O（B）累積排放量的影響Figure 4 Effects of fulvic acid potassium addition on cumulative emissions of CO（2A）and N2O（B）

圖5 N2O累積排放量與CO2累積排放量（A）和凈硝化速率（B）的相關關系Figure 5 Relationships between N2O cumulative emissions and CO2 cumulative emissions（A）and net nitrification rate（B）

土壤氮素轉化與有效碳源等因子有關[48]。在培養(yǎng)結束時，添加黃腐酸鉀顯著降低了土壤中的無機氮含量（圖1C），但增加了可溶性有機氮含量（圖1D），這可從外源碳的加入使土壤中微生物活性增大，大量的碳水化合物被微生物快速分解，甚至外源碳添加促進土壤中頑固性老有機碳的分解得到解釋[49-50]。

朱霞等[51]研究表明，可溶性碳的添加能間接增強土壤微生物反硝化作用，從而促進土壤N2O 排放。Burford 等[52]發(fā)現(xiàn)反硝化速率與水溶性碳含量呈極顯著相關，土壤中水溶性碳含量越多，反硝化速率越快，土壤N2O 排放量也大幅增加。簡言之，碳含量決定土壤硝化和反硝化量的大小[53]。從本研究結果中也可以看出，當氮肥和黃腐酸鉀同時施入土壤后，土壤N2O 排放速率顯著增加（P＜0.05，圖3B）。在培養(yǎng)初始，T1、T2、T3、T4 處理的N2O 排放速率分別為2 448.22、3 512.57、7 259.92、6 491.52 μg N·kg-1，分別是 CK 處理的 103、148、306、274 倍，說明向土壤中加入黃腐酸鉀，相當于以外源方式增加了微生物可利用的有效碳源，這不僅刺激了微生物同化作用，而且刺激了反硝化作用。續(xù)勇波等[54]研究也表明，易礦化的有機碳含量越高，反硝化過程中N2O 排放速率越大，N2O 被進一步還原的速率變小，N2O 總排放量增大。本實驗得出相同結果，N2O 累積排放量隨著黃腐酸鉀添加量的增大而增大（圖4B），且添加黃腐酸鉀處理的N2O 累積排放量均顯著高于CK 處理（P＜0.05）。另外，Gillam等[30]研究發(fā)現(xiàn)，N2O和N2排放量增加通常與土壤中-N 濃度增加有關，因為-N 是反硝化過程中作為N2O 生成的重要電子受體。但本實驗得出相反的結果，發(fā)現(xiàn)凈硝化速率與N2O 累積排放量呈顯著負相關關系（圖5B）。這可能與本實驗在開始時向土壤中加入等量的-N、-N和黃腐酸鉀刺激了微生物對-N同化有關。

Tilston 等[41]研究表明，添加外源碳可以提高微生物活性，與我們不同的是他們所用碳源是蔗糖和木屑。本實驗結果顯示，添加黃腐酸鉀處理的土壤呼吸速率顯著大于CK 處理（圖3A），且土壤呼吸速率隨黃腐酸鉀添加量的增大而增大。另外，添加黃腐酸鉀處理較CK 處理顯著增加了CO2累積排放量（圖4A），且黃腐酸鉀添加量與CO2累積排放量呈極顯著正相關（r=0.98，sig=0.000），說明添加黃腐酸鉀提高了微生物活性，且微生物活性隨黃腐酸鉀添加量的增大而增強。蘆思佳等[55]研究結果中也表明CO2累積排放量隨可溶性碳含量的增大而增大。另外，微生物呼吸作用增強，加快了土壤中O2的消耗，容易形成厭氧環(huán)境而促進反硝化作用[51]。因此，微生物呼吸作用增強也會導致N2O 排放量的增加。從本實驗結果也可以看出，N2O 累積排放量與CO2累積排放量呈顯著正相關關系（P＜0.001，圖5A），這與 Huang 等[56]研究結果中N2O累積排放量與CO2累積排放量的關系一致。

綜上所述，在室內培養(yǎng)試驗條件下，配施黃腐酸鉀對植煙土壤氮素轉化具有一定影響。但在種植煙草的田間條件下，煙株生長會吸收利用一部分氮素，根系分泌物也會對氮素轉化產生一定影響[57]，氮素還會發(fā)生徑流、淋洗損失等，黃腐酸鉀對氮素轉化的影響會與室內培養(yǎng)試驗有一定差異。因此，大田種植煙草條件下黃腐酸鉀對氮素轉化的影響需做進一步深入研究。另外，添加黃腐酸鉀可以明顯降低土壤中無機氮含量，那么在烤煙生長后期添加黃腐酸鉀是否可以作為一種調控植煙土壤后期氮素供應過多的措施？值得我們開展下一步工作去探究。

4 結論

（1）黃腐酸鉀作為一種高C/N 的碳源，對微生物同化作用的刺激大于對礦化作用的刺激；添加黃腐酸鉀可顯著降低土壤中的無機氮含量，且無機氮含量的降低值隨黃腐酸鉀添加量的增大而增大。同時，添加黃腐酸鉀也刺激了反硝化作用，顯著提高了N2O 累積排放量，且反硝化作用隨黃腐酸鉀添加量的增大而增強。

（2）向土壤中添加黃腐酸鉀能夠刺激微生物活性，顯著提高土壤呼吸速率和CO2累積排放量。另外，CO2累積排放量與N2O 累積排放量之間存在顯著的正相關關系，因此，CO2累積排放量可作為量化N2O累積排放量的輔助指標。