養(yǎng)殖廢棄物堆肥中抗生素和抗性基因的降解研究

宋婷婷，朱昌雄，薛 萐，李斌緒，張治國(guó)，李紅娜*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

我國(guó)作為世界上最大的畜禽養(yǎng)殖國(guó)，規(guī)?；图s化養(yǎng)殖迅速發(fā)展，導(dǎo)致畜禽糞便大量且集中產(chǎn)生。如何有效處理畜禽糞便成為當(dāng)今研究焦點(diǎn)。大規(guī)模畜牧業(yè)的快速發(fā)展給我國(guó)環(huán)境帶來(lái)了巨大的壓力：一方面，畜禽養(yǎng)殖業(yè)提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率和農(nóng)民收入，但另一方面，畜禽糞便中盡管含有豐富的N、C、P、K等大量元素，然而大多數(shù)畜禽糞便沒(méi)有得到合理的處理就在農(nóng)田中進(jìn)行施用，這勢(shì)必會(huì)造成土壤質(zhì)量下降和生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，也會(huì)對(duì)水體（地表水、農(nóng)田甚至地下水）造成嚴(yán)重污染。除此之外，畜禽糞便的處理不當(dāng)很容易引起病原菌的傳播，對(duì)畜禽本身和人類的健康造成嚴(yán)重的威脅[1-3]。其中畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用導(dǎo)致的環(huán)境污染問(wèn)題尤為突出，越來(lái)越受到各國(guó)研究學(xué)者的關(guān)注[4]?？股厥歉叩葎?dòng)植物以及真菌、細(xì)菌、放線菌等微生物在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的能夠抗病原體的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其通常是半合成、合成或純天然的化合物，用于抑制或者殺死人和動(dòng)物宿主中的細(xì)菌[5-6]。我國(guó)既是抗生素生產(chǎn)大國(guó)，也是抗生素使用大國(guó)，養(yǎng)殖業(yè)是抗生素使用的重要領(lǐng)域之一，每年用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)以及疾病預(yù)防和治療的抗生素就有超過(guò)8000 t[7-8]。Zhang等[9]對(duì)我國(guó)經(jīng)常使用的36種抗生素進(jìn)行調(diào)查得出，2013年，36種抗生素的總使用量達(dá)到92 700 t，其中大約有54 000 t通過(guò)人類和動(dòng)物排出，最終有53 800 t進(jìn)入受體環(huán)境。研究認(rèn)為，用于動(dòng)物的抗生素只有少量參與代謝而被利用，絕大部分抗生素以及在動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)生的抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）會(huì)隨著糞便和尿液排出動(dòng)物體外，從而對(duì)土壤以及水體中原本的微生物耐藥性產(chǎn)生越來(lái)越大的壓力，更嚴(yán)重的是會(huì)再次誘導(dǎo)產(chǎn)生ARGs，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)毒性和環(huán)境污染[10-11]。

1 畜禽養(yǎng)殖廢棄物中抗生素研究進(jìn)展

截至目前，已發(fā)現(xiàn)的抗生素達(dá)幾千種，常用的是大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、氨基糖苷類以及四環(huán)素類共六類?？股刈鳛橐环N有效治療人和動(dòng)物疾病以及作為激素促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的藥物，其在全球的醫(yī)藥行業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及畜牧養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[12]。由于不同生物對(duì)藥物的代謝程度不同，人類和動(dòng)物所攝入的抗生素有30%～90%都不能被完全吸收，而是隨著尿液和糞便一起排入到環(huán)境中[13-14]。此外，畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展大幅增加了獸用抗生素的使用量，而普遍過(guò)度使用抗生素的現(xiàn)象也進(jìn)一步提高了抗生素的排泄量和釋放量。

1.1 畜禽養(yǎng)殖廢棄物污染現(xiàn)狀以及抗生素殘留

大規(guī)模養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，使畜禽養(yǎng)殖中污染物急劇增加，最終導(dǎo)致各種農(nóng)業(yè)面源污染問(wèn)題。目前，我國(guó)畜牧業(yè)經(jīng)營(yíng)的總體情況是：養(yǎng)殖數(shù)量迅速增加，集約化程度高，糞便排放量大。牛、羊、豬是主要的養(yǎng)殖對(duì)象。根據(jù)中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局的數(shù)據(jù)（圖1），2017 年全國(guó)牛、羊、豬分別為 9 038.7 萬(wàn)、30 231.7 萬(wàn)、114 361.0 萬(wàn)頭。在過(guò)去的20 a 里，牛的養(yǎng)殖數(shù)量沒(méi)有顯著波動(dòng)，羊的數(shù)量緩慢增加，而豬的養(yǎng)殖數(shù)量波動(dòng)幅度最大。根據(jù)相關(guān)部門測(cè)算，1 頭約60 kg 的商品豬，日排尿量約為2.4 kg，排糞量約為3.8 kg，排放污水量約為18～24 kg，按照此方法計(jì)算，一個(gè)1 萬(wàn)頭豬的養(yǎng)殖場(chǎng)每年至少會(huì)產(chǎn)生糞便1.38 萬(wàn)t[15-16]。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2017 年我國(guó)養(yǎng)殖糞尿產(chǎn)量約為38 億t，但綜合利用率卻不足50%，這些養(yǎng)殖糞尿如果不能得到合理的處理，將會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生極大威脅[17]。

圖1 1996—2017年中國(guó)豬、牛、羊養(yǎng)殖情況Figure 1 Pig，cattle and sheep breeding in China from 1996 to 2017

我國(guó)既是世界上抗生素消耗量最大的國(guó)家，同時(shí)也是生產(chǎn)量最大的國(guó)家?？股卦谔岣呱L(zhǎng)速度、飼料利用率和減少疾病發(fā)生率方面的作用已被充分證明，但另一方面，飼料中抗生素的使用和誤用已導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品中藥物殘留和細(xì)菌耐藥性增加[18]。通常具有高殘留抗生素的畜禽糞便主要來(lái)自大型集約化養(yǎng)殖場(chǎng)，家庭散養(yǎng)含量較低。在飼養(yǎng)的畜禽中，豬糞中四環(huán)素類抗生素殘留量較高，牛糞中磺酰胺類的殘留量較高，雞糞排泄物中的抗生素類殘留量因地區(qū)而異[19]。畜禽養(yǎng)殖廢棄物中抗生素殘留量變化很大，可在μg·kg-1到g·kg-1之間（表1）。通過(guò)對(duì)不同學(xué)者研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)得出，主要的抗生素殘留是在豬糞、雞糞和牛糞中，其中豬糞是主要的殘留對(duì)象以及研究對(duì)象。豬糞中四環(huán)素類抗生素殘留量的變化范圍是1390～354 000 μg·kg-1，其他類抗生素的殘留量分別為：磺胺類170.6～89 000 μg·kg-1；氟喹諾酮類 411.3～1 516.2 μg·kg-1；硝基呋喃類85.1～158.1 μg·kg-1；大環(huán)內(nèi)酯類1.4～4.8 μg·kg-1（表1）。由表得出，四環(huán)素類抗生素整體趨勢(shì)為南方殘留量大于北方，且殘留量最高的省份是浙江，其殘留濃度明顯高于其他省份，最高的土霉素殘留量為354 mg·kg-1[25]。另外，美國(guó)集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬糞中金霉素殘留量是37 mg·kg-1，磺胺甲噻唑和磺胺甲惡唑?yàn)?9 mg·kg-1[21]，而我國(guó)金霉素殘留量最高為121.78 mg·kg-1[24]，磺胺類抗生素殘留量最高為15.93 mg·kg-1[20]?？傮w來(lái)看，我國(guó)畜禽糞便中金霉素和磺胺類抗生素殘留量低于美國(guó)。盡管四環(huán)素類抗生素是殘留的主要來(lái)源，但其他抗生素所帶來(lái)的污染也是不可忽視的。加之目前抗生素污染已極其普遍，如何監(jiān)測(cè)其殘留量變化以及尋找有效的降解方法尤為重要。

表1 不同畜禽廢棄物中抗生素殘留情況Table 1 Antibiotic residues in different livestock wastes

1.2 抗生素對(duì)作物以及土壤微生物的影響

畜禽養(yǎng)殖廢棄物作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)肥料的關(guān)鍵來(lái)源之一，尤其在蔬菜種植中，其施用量較大，在一些設(shè)施蔬菜種植中，糞肥的施用量可以占到總量的61%～88%[27]。Zhao等[28]研究了長(zhǎng)期施用（15 a）有機(jī)肥后14種目標(biāo)抗生素對(duì)花生的影響得出，抗生素大部分存在于花生組織（根、殼、粒、莖、葉）中，四環(huán)素是花生組織中主要的抗生素化合物，在根際土壤中含量較高，約占總抗生素的61%～80%。Dolliver 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，添加有機(jī)肥料的處理，所有被研究的作物（玉米、生菜、土豆）均可吸收磺胺甲嗪，其在植物組織中的濃度為0.1～1.2 mg·kg-1（干質(zhì)量）。Ahmed 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，添加3 個(gè)濃度（5、10、20 mg·kg-1）的四環(huán)素類抗生素均會(huì)明顯抑制番茄、黃瓜以及生菜的生長(zhǎng)。Migliore等[31]得出恩諾沙星濃度在 50～100 μg·kg-1之間時(shí)，可顯著改變植物的根長(zhǎng)、下胚軸、子葉和葉片的數(shù)量及長(zhǎng)度，高濃度（5000 μg·kg-1）會(huì)產(chǎn)生毒性作用，抑制效果最顯著的是對(duì)根的影響，而使用抗生素的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)作物的影響不顯著。

進(jìn)入土壤的抗生素，一方面能夠抑制甚至殺死土壤中的微生物，另一方面也能夠使某些微生物迅速繁殖，從而顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及活性，破壞群落結(jié)構(gòu)平衡，導(dǎo)致土壤活性下降[32]。Hammesfahr等[33]將不同濃度的磺胺嘧啶加入土壤進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，各濃度下的磺胺嘧啶都會(huì)使土壤中磷脂脂肪酸減少，且細(xì)菌和真菌的比例降低，甚至2 個(gè)月后的微生物群落結(jié)構(gòu)依舊在變化。Yang 等[34]研究土霉素對(duì)小麥根際土壤微生物活性影響試驗(yàn)的結(jié)果顯示，土霉素為10 mg·kg-1時(shí)，堿性磷酸酶活性的抑制率達(dá)41.3%，放線菌、細(xì)菌分別減少了31.7%和22.2%，當(dāng)土霉素濃度大于30 mg·kg-1時(shí)，堿性磷酸酶活性的抑制率則升高到64.3%～80.8%。Zhao 等[23]研究表明，四環(huán)素主要與厚壁菌門和綠彎菌門呈負(fù)相關(guān)，喹諾酮類與酸桿菌門、芽單胞菌門和消化螺旋菌門呈明顯的負(fù)相關(guān)，抗生素對(duì)生物活性或生物降解過(guò)程具有潛在的抑制作用。

綜上可知，抗生素在植物體內(nèi)的積累程度會(huì)因抗生素種類和濃度、土壤特性以及作物種類的不同而不同?？股貙?duì)植物的影響與其他多數(shù)污染物相似，即低劑量能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，高劑量則抑制其生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，抗生素可以在番茄、黃瓜、小白菜、生菜、蘿卜、菜豆等多種蔬菜中積累，金霉素、土霉素以及四環(huán)素等四環(huán)素類是主要的積累對(duì)象，但在萵苣和菠菜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素的積累，且在水果中抗生素的積累量小于蔬菜，同時(shí)酸堿度偏小的土壤含有低濃度抗生素能夠促進(jìn)小白菜的生長(zhǎng)，而在堿性土壤（黑土）則沒(méi)有顯著的影響。微生物對(duì)抗生素更加敏感，僅少量的抗生素就能夠抑制微生物的活性，且不同抗生素種類對(duì)微生物的菌群影響不同。除此之外，多種抗生素共存的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于單個(gè)化合物。植物中積累的抗生素可沿著食物鏈傳給人類，并可能對(duì)公眾健康構(gòu)成潛在威脅。此外，抗生素的存在能夠增加抗生素耐藥基因（ARGs）豐度，導(dǎo)致抗生素對(duì)人和動(dòng)物病原體的治療潛力降低[35-36]。因此，明確抗生素對(duì)生物健康的影響顯得越來(lái)越重要。

2 畜禽養(yǎng)殖廢棄物堆肥中抗生素的降解

2.1 抗生素的降解情況

堆肥是一種在初始階段控制濕度、pH 和C/N，且在微生物的作用下進(jìn)行分解的過(guò)程。理化因子對(duì)微生物的發(fā)育和有機(jī)物的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。堆肥過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)反映了整個(gè)過(guò)程的好壞[37]。堆肥由兩個(gè)主要階段組成，分別是嗜熱階段和成熟階段。嗜熱階段，有機(jī)物經(jīng)歷微生物分解、釋放二氧化碳和氨，有機(jī)物的降解伴隨著高溫釋放消滅病原體，最后易降解部分（糖類、氨基酸）完全礦化；成熟階段，木質(zhì)素等生物可降解性較差的有機(jī)物質(zhì)被降解，形成可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的肥料[38-39]。

抗生素的降解效果受多種因素的影響，如堆肥條件（溫度、濕度、pH、通風(fēng)等）的差異、抗生素類型、堆肥材料的性質(zhì)、糞便類型等都會(huì)影響畜禽糞便中抗生素的降解效率[41-42]。由表2 可知，堆肥對(duì)于四環(huán)素類抗生素的降解率為62.7%～99.0%，對(duì)磺胺類抗生素為0～99.99%，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的降解接近100%，然而堆肥不能有效降解喹諾酮類抗生素。不同種抗生素在不同糞便中的降解效率顯著不同，Winckler等[43]研究發(fā)現(xiàn)雞糞中的磺胺二甲基嘧啶在堆肥過(guò)程中沒(méi)有降解，并且認(rèn)為高溫是影響抗生素降解的主要因素。但Selvam 等[44]得出豬糞中的磺胺二甲基嘧啶在堆肥42 d 后降解率可以達(dá)到92%，且認(rèn)為pH 和溫度是降解抗生素的主要因素。沈東升等[45]通過(guò)對(duì)比添加和不添加土霉素降解菌劑TJ-1 得出，添加菌劑可以使抗生素的降解率提高20%，并認(rèn)為土霉素降解菌TJ-1 能夠緩解堆肥過(guò)程中有害物質(zhì)對(duì)微生物的損傷，從而保證了微生物群落的多樣性和活性。堆肥是一種通過(guò)有機(jī)物的生物降解來(lái)穩(wěn)定糞肥的有效方法?？偨Y(jié)得出，堆肥可以有效降解四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗生素。抗生素的降解受多種因素的影響，其中溫度和pH是最重要的影響因素。

2.2 堆肥中抗生素的降解機(jī)理

堆肥過(guò)程中，抗生素的理化性質(zhì)決定了它們的降解方式。此外，堆肥過(guò)程中物理化學(xué)條件、有機(jī)物的降解以及微生物的作用等均可改變抗生素的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其降解[49]。抗生素在堆肥中的降解主要包括光降解、水解以及生物降解3 種方式。生物降解被認(rèn)為是目前最為有效的降解方法，主要包括外源添加降解菌劑和普通高溫堆肥，這兩種方式能夠很好地阻止抗生素在食物鏈中的傳播[50-51]。Ezzariai 等[49]研究表明，抗生素的降解包括揮發(fā)、非生物和生物轉(zhuǎn)化、螯合以及礦化等幾個(gè)過(guò)程。Loke 等[52]對(duì)四環(huán)素類抗生素進(jìn)行研究得出，四環(huán)素類抗生素是多環(huán)并四苯羧基酰胺結(jié)構(gòu)，可通過(guò)脫水、異構(gòu)化等途徑發(fā)生分解，且認(rèn)為帶有四環(huán)結(jié)構(gòu)的四環(huán)素在堆肥中消減的主要因素是水解作用，且隨著堆肥溫度的升高而增強(qiáng)。Wu 等[53]得出相似的結(jié)果，認(rèn)為四環(huán)素類抗生素的降解可能與外膜化或脫水等非生物轉(zhuǎn)化有關(guān)。泰樂(lè)菌素降解主要進(jìn)行的是水解過(guò)程，在酸性條件下從A-泰樂(lè)菌素到B-泰樂(lè)菌素，在中性和在堿性條件下，該化合物與其他極性分解產(chǎn)物同時(shí)產(chǎn)生泰樂(lè)菌素-A-丁間醇醛，據(jù)報(bào)道，在整個(gè)pH（2～13）范圍內(nèi)，泰樂(lè)菌素的水解度都很高[54]。對(duì)于磺胺類化合物，這些分子濃度的下降可能與有機(jī)物的存在有關(guān)，有機(jī)物在堆肥過(guò)程中會(huì)在高溫下產(chǎn)生吸附位點(diǎn)，使其不易提取[55]。Loftin 等[56]對(duì)四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類的多種抗生素進(jìn)行降解機(jī)理研究，得出環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶在分子結(jié)構(gòu)上與金霉素和四環(huán)素明顯不同，磺胺嘧啶屬于磺酰胺類抗生素，其分子結(jié)構(gòu)中與胺基連接的磺?；榷喹h(huán)結(jié)構(gòu)更容易分解。Kim 等[57]在堆肥中添加木屑用于降解四環(huán)素，發(fā)現(xiàn)木屑對(duì)四環(huán)素的降解有顯著的正向作用；推測(cè)由于這些有機(jī)基質(zhì)中存在大量的二價(jià)陽(yáng)離子，并可能與有機(jī)物形成螯合物，因此吸附在降解過(guò)程中起主要作用。酪氨酸不與金屬離子形成復(fù)合物，但可以與糞肥中帶負(fù)電荷的化合物形成強(qiáng)化學(xué)鍵，加速可提取的抗生素水平的下降。綜上所述，不同種抗生素的降解過(guò)程存在差異，結(jié)合2.1的闡述，生物降解可能是導(dǎo)致抗生素減少的主要原因，但也有研究顯示，非生物過(guò)程如化學(xué)轉(zhuǎn)化、隔離等也是抗生素降解的原因。因此，將生物和非生物兩個(gè)過(guò)程結(jié)合起來(lái)闡述抗生素在堆肥中的降解機(jī)制應(yīng)當(dāng)是最優(yōu)策略。

表2 堆肥化處理對(duì)畜禽糞便中抗生素的降解效果Table 2 Effect of the composting treatment on the removal of antibiotics from livestock and poultry feces

2.3 堆肥中微生物群落的演變

微生物在堆肥中發(fā)揮著不可替代的作用，同時(shí)堆肥也使微生物的群落發(fā)生改變。Xia等[58]利用蚯蚓進(jìn)行堆肥，研究污泥中不同濃度的四環(huán)素（0、100、500、1000 mg·kg-1）對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落的影響發(fā)現(xiàn)，高濃度的四環(huán)素可以改善蚯蚓和微生物的活動(dòng)，從而延遲有機(jī)質(zhì)的腐殖化，微生物的豐度和多樣性隨四環(huán)素濃度的增加而減少，初始底物中的優(yōu)勢(shì)門由變形桿菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門組成，分別占總相對(duì)豐度的35%、19%、16%和10%，堆肥結(jié)束時(shí)，擬桿菌門數(shù)量明顯增加，且隨著抗生素濃度的增加而增加，表明擬桿菌對(duì)高濃度的四環(huán)素有很強(qiáng)的耐受性，且有研究證明蚯蚓在堆肥前期對(duì)微生物群落的影響更為強(qiáng)烈[59]，也有學(xué)者研究證明堆肥過(guò)程中抗生素濃度的變化，以及溫度、pH、水分均會(huì)影響微生物的群落結(jié)構(gòu)變化[60]。探討糠醛渣與林可霉素菌絲渣共堆肥對(duì)細(xì)菌群落的影響，得出厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、異常球菌門（Deinococcus-Thermus）是6 個(gè)最主要的優(yōu)勢(shì)門，占所有樣本細(xì)菌16S rRNA 總基因序列的99%以上，但隨著堆肥的進(jìn)行，放線菌逐漸增多[61]。Meng等[62]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥過(guò)程中嗜油極小單胞菌屬、假單胞菌屬、叢毛單胞菌屬、黃桿菌屬、反芻桿菌屬、密螺旋體桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬與GI（發(fā)芽指數(shù)）、TN 和NO-3-N 呈負(fù)相關(guān)，與 TOC 和 TOC∶TN 呈正相關(guān)，然而高溫單孢菌屬和熱多孢菌屬與NO-3-N、GI 和TN 呈正相關(guān)，與TOC、TOC∶TN 以及含水量呈負(fù)相關(guān)。Ren等[61]研究表明，堆肥后期處理組和對(duì)照組的微生物群落變得相似，認(rèn)為抗生素不影響堆肥結(jié)束時(shí)的群落結(jié)構(gòu)。其他學(xué)者也進(jìn)行了類似的研究，他們認(rèn)為堆肥的不同階段會(huì)影響細(xì)菌群落的進(jìn)化，而非殘留抗生素，殘留的抗生素可能只在開始和中溫階段影響細(xì)菌群落，一旦抗生素被降解到合適的水平，細(xì)菌就會(huì)迅速生長(zhǎng)，微生物群落變得越來(lái)越相似[63-64]。

3 畜禽養(yǎng)殖廢棄物堆肥中抗性基因（ARGs）的降解

3.1 ARGs的研究

ARGs是由于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中長(zhǎng)期不規(guī)范使用四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等各類抗生素，誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)一些細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，從而產(chǎn)生ARGs，經(jīng)排泄后將對(duì)周圍環(huán)境造成潛在的基因污染?？剐曰蛲ǔＮ挥谫|(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可動(dòng)遺傳因子上（Mobile genetic el?ement），能夠在環(huán)境中傳播和擴(kuò)散，對(duì)人類生活產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。細(xì)菌的固有抗藥或天然抗藥（Intrinsic resistance）是抗藥基因的重要起源之一，另一種起源是細(xì)菌在環(huán)境中抗生素和重金屬等多種污染物的選擇壓力，其通過(guò)人或者畜禽糞便隨著腸道細(xì)菌排出體外，這類ARGs 一旦產(chǎn)生將難以降解，他們有很強(qiáng)的移動(dòng)能力，是環(huán)境中ARGs 的重要來(lái)源之一[65]。ARGs與一般環(huán)境污染物不同，其能夠進(jìn)行自我擴(kuò)增且能在不同微生物之間傳播和轉(zhuǎn)移，顯示出特殊的環(huán)境行為特征，因此ARGs 的存在是抗藥性菌產(chǎn)生的根源，其已經(jīng)被定義為環(huán)境中的新型污染物并被大量研究[66-67]。

Zhao等[68]利用高通量測(cè)序分別對(duì)湖南、遼寧和浙江3個(gè)大型養(yǎng)殖場(chǎng)新型糞便中ARGs種類和豐度進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)到 146 個(gè) ARGs 且大約為 1.3×1010cop?ies·g-1，研究還發(fā)現(xiàn)飼料添加劑增加了豬腸道中ARGs 和可移動(dòng)基因元件（Mobile genetic elements，MGEs）的富集。對(duì)上海規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)廢水中ARGs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)tetB/P、tetM、tetO、tetW、sulA、sul1、sul2和sul3均有檢出，其中sul1豐度最高，可達(dá)8.4～10.4 logs[69]。黃福義等[70]利用高通量QPCR技術(shù)，研究福建省某梅花鹿養(yǎng)殖場(chǎng)中糞便的ARGs，共檢測(cè)出120 種ARGs 和MGEs，其中檢測(cè)出種類最多的是四環(huán)素類和氨基糖苷類，其次為胺酰醇類、氟喹諾酮類，均達(dá)11 logs 以上。利用QPCR 技術(shù)對(duì)牛糞、豬糞和豬糞堆肥中tetA、tetB/P、tetC、tetG、tetM、tetO、tetQ、tetT、tetS和tetW這 10 種 ARGs 進(jìn)行研究，3 種材料中均發(fā)現(xiàn)了此10 種 ARGs，且所有豬糞樣品中 10 種 ARGs 的拷貝數(shù)均高于牛糞[71]。Wang 等[72]對(duì)江蘇省16 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)糞便進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果tetM、tetO、tetQ、tetT、tetW這 5 種tet基因表達(dá)的核糖體保護(hù)蛋白豐度均高于tetA、tetC、tetE、tetG這 4 種外排泵蛋白表達(dá)豐度，且ermB、sul2以及tetM檢出率和豐度最高，檢出率可達(dá)90%以上，豐度可達(dá)109copies·g-1以上。

近些年隨著ARGs 污染的加重，QPCR 技術(shù)作為一種準(zhǔn)確表征ARGs 的手段越來(lái)越受到人們的青睞。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，豬糞是環(huán)境中ARGs 的主要來(lái)源，其中檢出比較多的分別是四環(huán)素類的tetA、tetB/P、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT和tetW；磺胺類的sul1和sul2；氨基糖苷類的aadA、aph33ib、aph6id和aac6ib；喹諾酮類的qnrA、qnrB和qnrS；大環(huán)內(nèi)酯類的ermB、ermC和ermA；多重耐藥基因的FloR和catA等，其他動(dòng)物的糞便中也有多種ARGs 被檢測(cè)到。然而目前的研究只集中于大型養(yǎng)殖場(chǎng)的畜禽糞便檢測(cè)，而對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)周圍水體、土壤以及空氣的研究較少，因此將所有可能存在ARGs 的介質(zhì)結(jié)合起來(lái)研究，將能準(zhǔn)確且更好地監(jiān)測(cè)ARGs的變化情況。

3.2 堆肥中ARGs的降解情況

為了減少畜禽養(yǎng)殖中ARGs 向環(huán)境中擴(kuò)散和傳播，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開始重視并研究利用生物處理技術(shù)對(duì)畜禽糞便中ARGs 的消減。Chen 等[60]研究抗生素對(duì)豬糞堆肥過(guò)程中多重抗生素ARGs 影響，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類ARGs 與其他ARGs 存在交叉抗性和共同抗性，且發(fā)現(xiàn)高溫期和腐熟期是降解ARGs 的關(guān)鍵時(shí)期。Peng等[73]研究顯示，添加劑（過(guò)磷酸鈣和沸石）能減少雞糞好氧堆肥過(guò)程中ARGs，降解率為67.3%～86.5%，且能有效降低高溫期致病菌的相對(duì)豐度。Jang 等[74]利用好氧高溫堆肥技術(shù)得出，堆肥結(jié)束時(shí)，四環(huán)素類ARGs 降解率為50.03%～100%，磺胺類為93.93%～97.17%，喹諾酮類為81.61%～97.28%，β-內(nèi)酰胺類為80.02%～100%，而大環(huán)內(nèi)酯類ARG 僅為20.39%。研究表明，不同堆肥理化條件對(duì)畜禽糞便中的ARGs 有一定降解作用，但具體效果存在差別。Zhang 等[75]以天然沸石、零價(jià)納米鐵和Dnase 為變量，探討豬糞中溫和高溫厭氧發(fā)酵過(guò)程中ARGs 的變化，研究得出，可以減少除了tetM和sul2的大部分ARGs，天然沸石和零價(jià)鐵的添加可以促進(jìn)ARGs 的減少，MRGs 的共同作用為ARGs 的變化貢獻(xiàn)了86.5%～89.9%，且得出高溫比中溫厭氧發(fā)酵達(dá)到的效果要更好。Barkovskii 等[76]研究發(fā)現(xiàn)，盡管新鮮糞肥中存在大量的tetB，但經(jīng)過(guò)厭氧氧化塘處理后，tetB完全降解。除氧含量外，溫度高低同樣影響ARGs 的降解。Diehl 等[77]發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增加，tetX和tetA等基因的降解速率增加，得出ARGs 的降解可能與溫度變化下宿主菌的演替有關(guān)。

無(wú)論是好氧堆肥還是厭氧堆肥對(duì)ARGs 的降解都有一定的效果，但因堆肥方法以及抗生素的種類不同而存在差異。堆肥對(duì)四環(huán)素類ARGs、β-內(nèi)酰胺類ARGs、氨基糖苷類ARGs、磺胺類ARGs 以及喹諾酮類ARGs 都有一定的降解效果，但對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類ARGs沒(méi)有顯著的降解效果。目前堆肥溫度最高可達(dá)70 ℃以上，且總結(jié)得出高溫是降解ARGs 的主要因素，因此可以延長(zhǎng)堆肥的高溫期以提高ARGs 的降解率。已有研究證明通過(guò)添加沸石、過(guò)磷酸鈣以及零價(jià)納米鐵等可以提高ARGs 的降解率，但其對(duì)堆肥理化性質(zhì)、抗生素的影響還缺少研究。因此找到既能有效降解ARGs，又能提高抗生素降解率的方法是研究的重中之重。

3.3 ARGs的傳播和擴(kuò)散機(jī)理

水平基因轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfer，HGT）和垂直基因轉(zhuǎn)移（Vertical gene transfer，VGT）是ARGs傳播擴(kuò)散的主要機(jī)制。其中，HGT 是以MGEs 作為載體，通過(guò)接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等作用使ARGs傳播，ARGs可以在同種細(xì)菌甚至是不同細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移和傳遞。VGT 主要是通過(guò)微生物的自我繁殖使得ARGs 在土壤、空氣以及水體等不同環(huán)境中傳播擴(kuò)散[78]。兩種形式都可以使細(xì)菌的耐藥性快速傳播，因此會(huì)使ARGs導(dǎo)致的環(huán)境問(wèn)題不斷加劇，同時(shí)由于ARGs 能夠在不同介質(zhì)中傳播以及持久性強(qiáng)，使得其危害比抗生素本身對(duì)環(huán)境的危害更嚴(yán)重[79]。

Roberts[80]研究認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類ARGs 中的ermB基因型是erm類基因型中最多的基因，共有33個(gè)基因型，因?yàn)槠渚哂胸S富的基因型，所以在環(huán)境中更容易傳播和擴(kuò)散，從而導(dǎo)致其在堆肥樣品中豐度更高。對(duì)四環(huán)素ARGs 與轉(zhuǎn)座子intII的豐度改變和分布特征的研究得出，ARGs 的增值與intII有關(guān)[81]，然而有報(bào)道稱，MEGs 和微生物群落結(jié)構(gòu)能夠影響ARGs 的分布和歸趨[82]。tetG、tetA以及tetB等四環(huán)素類 ARGs 的宿主大部分都是革蘭氏陰性細(xì)菌（Gram-negative bacte?ria，G-），而厭氧堆肥占主導(dǎo)地位的細(xì)菌正是G-，因此厭氧處理對(duì)該類ARGs 的削減有內(nèi)在的優(yōu)勢(shì)。Dowd等[83]通過(guò)好氧堆肥技術(shù)得出，隨著堆肥溫度的升高，芽胞菌屬和嗜熱菌屬等耐熱菌成為優(yōu)勢(shì)菌，然而糞便中的腸道菌基本只能耐中溫，因此在環(huán)境脅迫下被淘汰，因而其含有的ARGs 也就會(huì)消失。抗生素濃度的高低也是影響ARGs 的又一因素。Zhu 等[84]研究得出，在高濃度抗生素的畜禽糞便中，ARGs與轉(zhuǎn)座基因呈正相關(guān)關(guān)系，此說(shuō)明在高抗生素的狀態(tài)下，HGT 在ARGs 的富集中起著關(guān)鍵作用。ARGs 的傳播和擴(kuò)散主要受水平轉(zhuǎn)移和垂直轉(zhuǎn)移的影響，且在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中會(huì)因抗生素的種類和濃度、細(xì)菌群落的變化以及環(huán)境理化性質(zhì)的不同而不同。微生物的參與使問(wèn)題變得更加復(fù)雜，但由于微生物的多樣性和特殊性，也有可能是解決問(wèn)題的突破口，因此從微生物出發(fā)，結(jié)合多方面因素探討ARGs 在堆肥過(guò)程中的變化具有重要的意義。

4 結(jié)論和展望

抗生素在多種畜禽糞便中被檢測(cè)到，殘留量最高的是豬糞，其次是雞糞和牛糞。各類畜禽廢棄物中殘留量最高的是四環(huán)素類抗生素，范圍約為354 000～11 μg·kg-1。堆肥對(duì)于抗生素和 ARGs 具有很好的降解效果，其中對(duì)四環(huán)素類抗生素降解率為62.7%～99%，對(duì)磺胺類抗生素為0～99.99%，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素降解率接近100%。堆肥中，四環(huán)素類ARGs 降解率為50.03%～100%，磺胺類為93.93%～97.17%，喹諾酮類為81.61%～97.28%，β-內(nèi)酰胺類為80.02%～100%，而大環(huán)內(nèi)酯類ARGs 僅為20.39%?？偨Y(jié)得出溫度和pH是影響抗生素降解的最主要原因，ARGs的降解效果主要是受溫度的影響，且添加沸石、過(guò)磷酸鈣等物質(zhì)能顯著提高ARGs的降解效率。

通過(guò)總結(jié)抗生素的危害、不同堆肥處理方式對(duì)抗生素和ARGs 的降解效果，結(jié)合抗生素和ARGs 降解機(jī)制以及不同抗生素之間的相互作用，希望能為更深入地研究和探討抗生素和ARGs 提供理論支撐。未來(lái)的研究方向包括：

（1）通常認(rèn)為高溫堆肥是降解抗生素和ARGs 的最環(huán)保和最有前景的方案。然而，大量試驗(yàn)都是在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬堆肥，對(duì)真正環(huán)境中自然堆肥的降解機(jī)制還缺少研究，所以希望加強(qiáng)對(duì)自然堆肥條件下抗生素和ARGs的研究，并闡明內(nèi)在的降解機(jī)制。

（2）總結(jié)發(fā)現(xiàn)，抗生素在堆肥前期降解效果好，但部分ARGs 隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)而豐度增加，且堆肥結(jié)束后微生物群落趨于一致?；诖?，今后應(yīng)當(dāng)從縮短堆肥時(shí)間、增添特異性加菌劑、調(diào)節(jié)堆肥體系以及環(huán)境因素等方面開展優(yōu)化研究，同時(shí)對(duì)ARGs 降解與堆肥不同時(shí)期微生物的群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行深入研究。

（3）考慮到堆肥產(chǎn)品最終用于田間，為減少抗生素、ARGs的傳播和擴(kuò)散，建議盡快建立肥料產(chǎn)品中抗生素和ARGs 的監(jiān)控體系，以規(guī)范肥料的使用，這也是解決污染進(jìn)一步傳播的有效方法。