基于三維熒光光譜檢測水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠殘留量

李寧馳，任諾鈺 ，劉春宇，2* ，姚治海，2，蔡紅星

1. 長春理工大學(xué)理學(xué)院光譜探測科學(xué)與技術(shù)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130012 2. 吉林省求是光譜數(shù)據(jù)科技有限公司，吉林 長春 130012

引 言

水產(chǎn)品因其營養(yǎng)和藥用價(jià)值被人們廣泛接受，我國2018年的水產(chǎn)品年產(chǎn)量已超過7 000萬噸。然而，在如此巨大的消費(fèi)量和產(chǎn)量下卻存在著一個(gè)重大問題，即有個(gè)別不法商家使用國家禁用藥物孔雀石綠作為殺菌劑。

孔雀石綠(Malachite green，MG; 分子式: C23H25N2Cl)是一種三苯甲烷類物質(zhì)[1]。作為一種工業(yè)染料[2]，因其具有良好的殺菌能力，被用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖和保鮮。[3]但據(jù)相關(guān)研究人員表明, 孔雀石綠及隱性孔雀石綠對(duì)哺乳動(dòng)物組織具有不可逆的損傷，故而許多國家都將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。

孔雀石綠化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，會(huì)快速代謝成相對(duì)穩(wěn)定的具有親脂性的無色隱性孔雀石綠(Leuco-malachite green，LMG; 分子式: C23H26N2)，LMG可輕易地透過動(dòng)物組織的間隙，且 LMG本身具有高毒性，對(duì)哺乳動(dòng)物有致癌、致畸等危害，因其親脂性和不易分解的特點(diǎn)，LMG易在人體內(nèi)積蓄，對(duì)人類健康會(huì)產(chǎn)生長期的威脅[4]。因此，研究一種針對(duì)水產(chǎn)品中MG及LMG殘留的方便快捷的檢測方法具有重要意義。

圖1 孔雀石綠分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The molecular structure of MG

圖2 隱性孔雀石綠分子結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The molecular structure of LMG

經(jīng)過科研人員的不斷研究，國際市場上已有多種檢測方案，較為常見的有高效液相色譜法[5]、紫外光譜法[6]，此外還有檢測精度較高的分子印跡技術(shù)[7]、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)[8]、傳感器檢測法[9]等； 然而高效液相色譜法雖然應(yīng)用廣，但檢測周期長、操作復(fù)雜，紫外光譜法檢出限較高, 測定結(jié)果易受實(shí)際樣品中基體干擾[6]，分子印跡技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)特異性強(qiáng)但檢測成本高，前期準(zhǔn)備復(fù)雜。相比之下，三維熒光光譜檢測法有低成本、方便快捷等優(yōu)勢，但由于MG熒光性弱，該方法進(jìn)展緩慢。

不過，雖然MG為弱熒光物質(zhì)，但MG在動(dòng)物體內(nèi)代謝物L(fēng)MG熒光性強(qiáng)，且易在魚類脂肪中積累。通過三維熒光光譜檢測法，可快速精準(zhǔn)、高效簡便的檢測LMG的含量，由此分析出水產(chǎn)品是否被非法添加MG。其便捷性、低成本、易操作的特點(diǎn)可以滿足我國的檢測需要。本文將圍繞三維熒光光譜檢測技術(shù)，討論LMG的最佳檢測條件及其可行性，旨在提供一種針對(duì)水產(chǎn)品中MG和LMG殘留的檢測新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

LMG標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，阿拉丁試劑(上海)有限公司)； 乙醇、甲醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉(北京化工廠)； 新鮮龍利魚切片(長春前進(jìn)廣場沃爾瑪超市)； 去離子水。

天津拓普WFY-28型熒光分光光度計(jì)(光源為150 W氙燈，激發(fā)波長范圍220～760 nm，發(fā)射波長范圍220～760 nm)。

1.2 方法

1.2.1 LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液的三維熒光光譜測定

準(zhǔn)確稱取兩份0.5 g LMG標(biāo)準(zhǔn)品，分別以乙醇、甲醇為溶劑配制成1 mg·mL-1LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液各500 mL。

取2 mL待測液于比色皿內(nèi)，置于光譜儀中； 選定發(fā)射光譜掃描，設(shè)置發(fā)射狹縫、激發(fā)狹縫、發(fā)射單色器波長范圍等參數(shù)； 在激發(fā)波長295～330 nm范圍內(nèi)對(duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行三維熒光光譜測量； 整合數(shù)據(jù)，制作三維熒光光譜。

1.2.2 LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液的最佳檢測條件的測定

分別配制pH值為3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8，6.2，6.6，7.0，7.4和8.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，以及8.6，9.0，9.4，9.8，10.2的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液各50 mL，作為梯度緩沖液保存。

分別取LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液2 mL，加入18 mL某pH值緩沖液，溶液變?yōu)闇啙幔瑩u勻，溶液成乳白色。參考此方法配制系列pH值LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液共34份，密封保存。

調(diào)整光度計(jì)各項(xiàng)參數(shù)，設(shè)置激發(fā)波長為320 nm，分別對(duì)系列pH的LMG溶液和緩沖液進(jìn)行熒光光譜檢測，得到數(shù)據(jù)并保存； 以pH值為x軸，熒光峰峰值強(qiáng)度(intensity)為y軸，制作熒光峰峰值強(qiáng)度隨pH變化曲線。

1.2.3 穩(wěn)定性分析

將濃度為 1 mg·mL-1的LMG-乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙醇稀釋為濃度1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1和0.01 mg·mL-1的系列濃度乙醇稀釋液。密封保存； 用pH7.0的緩沖液將系列濃度的稀釋液準(zhǔn)確稀釋10倍，配制成濃度為0.1，0.08，0.06，0.04，0.02，0.01和0.001 mg·mL-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)稀釋液； 調(diào)整光譜儀各項(xiàng)參數(shù)，設(shè)置激發(fā)波長為320 nm對(duì)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行測量，得到數(shù)據(jù)并保存，以LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg·mL-1)為x軸，以平均峰值作為y軸，制作LMG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 對(duì)魚肉樣品的測定

在無菌條件下，將龍利魚魚肉分割成若干份長寬高約為20 mm×10 mm×2 mm的長方體，分別用濃度為0.1，0.08，0.04，0.02和0.01 mg·mL-1的不同濃度的LMG-乙醇稀釋液浸泡十分鐘，并取一份用酒精浸泡十分鐘作為空白對(duì)照組。調(diào)整光譜儀各項(xiàng)參數(shù)，設(shè)置激發(fā)波長為320 nm對(duì)各組魚肉樣品進(jìn)行測量，每組測量三次，并保存數(shù)據(jù)，以LMG-乙醇稀釋液的濃度為x軸，以熒光峰平均峰值作為y軸，制作魚肉樣品熒光峰平均峰值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 LMG的三維熒光光譜分析

分析整理實(shí)驗(yàn)1.2.1的數(shù)據(jù)，得到LMG-乙醇溶液三維熒光光譜圖，如圖3所示； LMG-甲醇熒光光譜圖，如圖4所示。

圖3 LMG-乙醇溶液三維熒光光譜圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectraof LMG-ethanol solution

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在發(fā)射波長340～440 nm、激發(fā)波長290～330 nm的范圍內(nèi)，LMG-乙醇溶液有一個(gè)明顯的熒光峰peak1(激發(fā)波長320～326 nm/發(fā)射波長350～362 nm)，最高峰值max 1在激發(fā)波長324 nm/發(fā)射波長355 nm處。

LMG-甲醇溶液同樣有且只有一個(gè)熒光峰peak2(激發(fā)波長317～323 nm/發(fā)射波長342～362 nm)，最高峰值max2在激發(fā)波長320 nm/發(fā)射波長355 nm處。

乙醇和甲醇也具有各自的熒光峰，其中乙醇熒光性弱，對(duì)本實(shí)驗(yàn)干擾可忽略，甲醇有兩個(gè)熒光峰，分別位于225/350 nm和250/375 nm處，與peak2的位置沒有沖突，故而可以判定peak1和peak2為LMG的熒光峰，可作為進(jìn)一步討論依據(jù)。

圖4 LMG-甲醇溶液三維熒光光譜圖Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectraof LMG-methanol solution

2.2 pH變化對(duì)LMG熒光效果影響

LMG在不同的pH環(huán)境中所呈現(xiàn)的熒光峰強(qiáng)度和效果不盡相同，通過實(shí)驗(yàn)1.2.2整理得到的熒光峰峰值強(qiáng)度平均值隨pH變化曲線，來探究LMG的最佳檢驗(yàn)pH環(huán)境。

圖5 LMG-乙醇溶液熒光峰峰值強(qiáng)度平均值隨pH變化曲線

Fig.5 The curve of the average fluorescence peak intensity of LMG-ethanol solution with the change of pH value

圖6 LMG-甲醇溶液熒光峰峰值強(qiáng)度平均值隨pH變化曲線

Fig.6 The curve of the average fluorescence peak intensity of LMG-methanol solution with the change of pH value

檢測得，實(shí)驗(yàn)所用緩沖液基本無熒光，可忽略其熒光影響。因此可以判定本實(shí)驗(yàn)所用緩沖液只能提供不同pH環(huán)境，而對(duì)LMG的檢測無影響。

由圖5和圖6可得，LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液熒光強(qiáng)度在pH值3.4～10.4范圍內(nèi)有一個(gè)峰，且在pH 7.0時(shí)達(dá)到最高，可以判定，LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液均在pH 7的環(huán)境中最適合熒光光譜檢測。淡水養(yǎng)殖池塘的水體pH一般在7～8.5左右[10]，該環(huán)境下LMG有較強(qiáng)的熒光效果，故而用熒光光譜檢測法檢測水產(chǎn)品中的LMG有良好的適應(yīng)性，無需對(duì)待測樣品進(jìn)行繁瑣的前期處理。

2.3 穩(wěn)定性分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證熒光峰強(qiáng)度和LMG濃度的關(guān)系，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)1.2.3，收集數(shù)據(jù)，以LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg·mL-1)為x軸，以平均峰值作為y軸，制作并得到LMG的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)，得到回歸方程y=491.780 82x+7.224 66, 相關(guān)系數(shù)r=0.970 87，根據(jù)線性擬合的相關(guān)系數(shù)r可知，LMG濃度和熒光峰強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，因此，可以說明LMG的熒光光譜檢測法有較好的穩(wěn)定性，可以用于LMG濃度的測定，計(jì)算得回收率為94.546%，這表明三維熒光光譜法檢測LMG有較高的精度。

圖7 LMG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of LMG

2.4 魚肉檢測分析

在確定了LMG的熒光峰位置和熒光效果與pH的關(guān)系后，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)1.2.4對(duì)魚肉樣品在中性環(huán)境中進(jìn)行檢測，以進(jìn)一步驗(yàn)證本檢測方法的可行性。整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制作魚肉樣品熒光強(qiáng)度隨隱性孔雀石綠濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)，得到回歸方程y=313.191 13x+3.301 54，相關(guān)系數(shù)r=0.989 77, 由相關(guān)系數(shù)可知： 魚肉樣品中LMG濃度和熒光峰強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，因此，三維熒光光譜檢測法可以檢測魚肉樣品中LMG，并分析其濃度。計(jì)算得魚肉樣品的回收率為96.65%，表明三維熒光光譜法對(duì)魚肉樣品中LMG的含量檢測有較好的靈敏性，更加證明了該方法的可行性。

相比于應(yīng)用廣泛的高效液相色譜法[11](回收率66.01%～76.34%)及其衍生方法，如柱前電化學(xué)衍生法[12]、液質(zhì)聯(lián)用法[13]、液相色譜-紫外熒光法[14]等，三維熒光光譜檢測法有較為可觀的精度和操作簡單的優(yōu)勢，而對(duì)比與以高精度為特點(diǎn)的分子印跡技術(shù)[7]、傳感器檢測[9]、CdTe量子點(diǎn)表面分子印跡熒光探針技術(shù)[15]等方法，本方案在保證良好精度的同時(shí)具有方便快捷、取樣簡單、測量周期短、成本低等優(yōu)勢，更適合廣泛的應(yīng)用于對(duì)水產(chǎn)品中LMG的檢測和濃度分析。

圖8 三維熒光光譜法測得不同濃度LMG處理后魚肉樣品的熒光強(qiáng)度圖Fig.8 Standard curve of fish samples were obtained bythree-dimensional fluorescence spectroscopy

3 結(jié) 論

在發(fā)射波長340～450 nm范圍內(nèi)，LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液的三維熒光光譜且只有一個(gè)峰，分別位于peak1(激發(fā)波長320～326 nm/發(fā)射波長350～362 nm處)、peak2(激發(fā)波長317～323 nm/發(fā)射波長342～362 nm處)，可以確定該熒光峰為LMG熒光，激發(fā)波長320 nm/發(fā)射波長355 nm左右為LMG最佳吸收波長。三維熒光光譜法檢測LMG在pH 7.0的環(huán)境下熒光效果最好，且緩沖液熒光干擾可忽略不計(jì)，證明該方法在用于水產(chǎn)品的檢測時(shí)無需對(duì)樣品特殊處理就可得到最佳檢測效果。LMG溶液和魚肉樣品的熒光效果和LMG濃度有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.970 87和0.989 77, 接近于1，回收率為94.546%和 96.65%，證明該方法適于水產(chǎn)品中LMG濃度的分析檢測，且精度較高。

對(duì)比市場上已有的對(duì)于水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠的檢測方法，三維熒光光譜法因其高精度、取樣簡單、方便快捷、低成本等特點(diǎn)，更有利于解決我國水產(chǎn)品質(zhì)檢存在的待測樣品多、檢測成本高等問題，可進(jìn)一步提高質(zhì)檢效率，緩解質(zhì)檢壓力，有望成為新一代檢測方法投入使用。