馬鈴薯薯形基因StOFP20的克隆*

艾菊， 張泓欣, 羅威， 高冬麗

(云南師范大學(xué) 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯原產(chǎn)于南美洲的安第斯山區(qū)，是茄科茄屬一年生的雙子葉植物.由于其耐性強(qiáng)、豐產(chǎn)性高、適應(yīng)性廣且營養(yǎng)成分全，在我國已經(jīng)成為繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物[1].馬鈴薯塊莖是生長在土壤中的縮短而肥大的變態(tài)莖.塊莖形狀簡稱為薯形，是馬鈴薯的重要農(nóng)藝性狀.薯形在塊莖形成早期既已確定，不同的薯形是因?yàn)樵趬K莖形成過程中，細(xì)胞向各個(gè)方向分裂和增大的速度不同所造成的[2-3].現(xiàn)有的栽培品種薯形比較規(guī)則，一般為圓形、橢圓形或長形.各地消費(fèi)者對(duì)薯形的喜好不同，不同加工目的對(duì)薯形的要求也不同，因此薯形的選育將滿足消費(fèi)習(xí)慣的需求，加速馬鈴薯加工業(yè)的發(fā)展.

Van Eck等人首次詳細(xì)地研究了薯形的遺傳規(guī)律，利用二倍體雜交群體將控制圓形薯形的基因(Ro)定位在10號(hào)染色體，且圓形相對(duì)于長形是顯性的[4].Prasher等利用二倍體雜交群體定位了2個(gè)薯形主效數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，分別位于2號(hào)和10號(hào)染色體上，10號(hào)染色體上的QTL效應(yīng)大于2號(hào)染色體上的QTL，此外還有3個(gè)微效QTL位于其他染色體上[3].Lindqvist-Kreuze等利用二倍體回交群體將薯形主效QTL定位在10號(hào)染色體上，此外在5號(hào)和12號(hào)染色體上的兩個(gè)微效QTL對(duì)薯形也有影響[5].綜上所述，薯形是一個(gè)相對(duì)簡單遺傳的性狀，10號(hào)染色體上的Ro基因是控制塊莖形狀的主效位點(diǎn)，也存在其他位點(diǎn)的修飾效應(yīng).Endelman等在2016年將Ro基因定位在48.2-51.9 Mb的區(qū)間內(nèi)[6].

番茄和馬鈴薯同屬于茄科作物.目前已經(jīng)克隆調(diào)控番茄果形的多個(gè)基因，包括SUN、OVATE、FAS(Fasciated)、sov1(suppressor of ovate ) 等[6-9].OVATE和sov1均屬于OFP(Ovate Family Protein)家族，其中OVATE編碼SlOFP1，sov1編碼SlOFP20.Wu等人利用薯形分離群體發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中的同源基因StOFP20與薯形緊密連鎖，是Ro位點(diǎn)的編碼基因，因此，OFP20不僅調(diào)控番茄果實(shí)形狀，同時(shí)也是馬鈴薯薯形的調(diào)控因子[10].但是，在Wu等的研究中沒有提供StOFP20的編碼序列，StOFP20在參考基因組DM中也是缺失的，且馬鈴薯DM基因組中約含有25個(gè)OFP基因，因此通過圖位克隆，明確StOFP20的編碼序列是必要的.研究利用一個(gè)薯形分離的群體，克隆了StOFP20，為進(jìn)一步研究薯形調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 DNA提取

將馬鈴薯的種子完全浸泡在2 mg/L的赤霉素溶液中，待24 h后將種子播種至濕度適中的土壤中.約15 d左右，將長出的一定高度的小苗移栽至96孔的穴盤內(nèi)，待其長至約四片幼葉后進(jìn)行采樣.采集馬鈴薯的幼葉1-2片，采用CTAB法提取C151群體后代的基因組DNA.

1.2 分子標(biāo)記驗(yàn)證

在前期的研究中，已經(jīng)對(duì)C151自交群體進(jìn)行了Bin分型[11].本研究利用16份Bin基因型不同的植株對(duì)InDel標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系為：PCR體系11 μL，其中2×PCR master mix(Promega)5.5 μL，正向引物(10 μM)0.25 μL，反向引物(10 μM)0.25 μL,去離子水 4 μL,DNA 1 μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃,3 Min;35個(gè)循環(huán)：94 ℃,30 Sec,55 ℃,30 Sec,72 ℃,15 Sec,循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 5 Min.擴(kuò)增片段用丙烯酰胺凝膠電泳鑒定.所用標(biāo)記的引物序列為：S3aF-TTAGTGTAGGGGTAAAATGG,S3aR-TGCAGACCCTTAAACTTGTC;S4aF-GACTCTCAAAGAGGACGTTG,S4aR-TCCTCCAAGTGACTGAGACT;S5aF-CCCCTCCTTGACTTTTATTT,S5aR-ATACCCTTGGAGAAAATGGT; i-5F-ATTTAGGTGGGTTGAAGTGA, i-5R-ATAATCAACAGCCCATTCCT.

1.3 StOFP20的克隆

以葉片CDNA為模版，從后代分離群體中擴(kuò)增StOFP20的序列.擴(kuò)增引物為StOFP20F-A T G G G G A A T T A T A G G T T T A G A T T A T;S t O F P 2 0 R-T T A C T T C A G T C G A A T T T C A G T G A T G.StOFP20與SlOFP20的相似性比對(duì)采用NCBI blastp，OVATE結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用NCBI的Conserved Domain Search Service(CD Search).

2 研究結(jié)果

2.1 薯形分離群體的構(gòu)建

C151是一個(gè)自交親和的二倍體材料.利用該材料進(jìn)行自交，自交后收獲果實(shí)，并進(jìn)行F2代播種(圖1).對(duì)F2代植株的薯塊進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)薯形出現(xiàn)圓形和橢圓形的分離，且在結(jié)薯初期能清楚地用肉眼進(jìn)行表型鑒定(圖2).

從左到右依次為：親本CIP151的花；自交后的果實(shí)；經(jīng)過清洗后的種子；播種后的幼苗

圖1 自交分離群體的構(gòu)建

Fig.1 Construction of a segregating population for tuber shape

從左到右依次為：親本CIP151的薯形；后代的圓形薯塊；后代的橢圓形薯塊

圖2 親本CIP151自交后代的薯塊形狀

Fig.2 Tuber shape of the progeny obtained by selfing of the parent C151

2.2 StOFP20的精細(xì)定位

該群體的植株均已測(cè)序，并進(jìn)行了Bin分型[11].根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的薯形基因的定位區(qū)間[6]，對(duì)該群體的相應(yīng)區(qū)間48-52 Mb進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)基因型與表型相符合，即基因型為b和h時(shí)，薯形為圓，基因型為a時(shí)，薯形為橢圓.根據(jù)基因型和表型，將區(qū)間定位在bin61-bin63之間，物理距離為834 kb(表1).在Bin61-Bin63之間設(shè)計(jì)多態(tài)性引物，并進(jìn)行驗(yàn)證，找到4個(gè)能區(qū)分a、b和h基因型的InDel標(biāo)記，分別為S3a、S4a、S5a和i-5，其中i-5的標(biāo)記驗(yàn)證如圖3所示.利用這4個(gè)標(biāo)記對(duì)Bin61-Bin63之間的重組體進(jìn)行分型，最終得到3種有效的重組體.C151-0758重組體的交換發(fā)生在S3a和S4a之間，基因型為ah，表型為圓形，說明基因在S3a之后；C151-0809重組體的交換發(fā)生在S5a和i-5之間，基因型為ah，表型為橢圓形，說明基因在i-5之前；C151-0044重組體的交換發(fā)生在S5a和i-5之間，基因型為ha，表型為圓形，說明基因在i-5之前.綜上信息，將薯形基因定位S3a和i-5之間，物理距離為298 kb(圖4).

表1 Ro基因的初步定位

圖3 InDel分子標(biāo)記i-5的開發(fā)

白色方框代表a基因型，即橢圓形基因型，黑色方框代表h基因型，即圓形基因型，箭頭所指方向?yàn)榛蛩诘姆较?/p>

圖4Ro基因的精細(xì)定位

Fig.4 Fine-mapping of theRogene

2.3 StOFP20的克隆

以SlOFP20的序列比對(duì)該區(qū)間的基因，找到了同源基因StOFP20，該基因全長為1 041 bp，不含有內(nèi)含子.利用薯形分離的植株擴(kuò)增StOFP20，發(fā)現(xiàn)在基因型為b即圓形塊莖中能夠擴(kuò)增出來，在基因型為a即橢圓形塊莖中不能擴(kuò)增出條帶，與StOFP20在長形的DM塊莖中缺失情況一致(圖5).SlOFP20和StOFP20序列均有OVATE結(jié)構(gòu)域，其蛋白相似性達(dá)到80%(圖6).

圖5 StOFP20在圓形薯塊(基因型為b)和橢圓形薯塊(基因型為a)中的擴(kuò)增

方框?yàn)镺VATE結(jié)構(gòu)域

圖6 StOFP20和SlOFP20的蛋白序列比對(duì)

Fig.6 Protein sequence alignment of StOFP20 and SlOFP20

3 討 論

OFP基因數(shù)量眾多，在擬南芥中有18個(gè)OFP基因[12]，在水稻和番茄中分別鑒定出31個(gè)和23個(gè)OFP基因[13].Liu等利用同源基因比對(duì)，在馬鈴薯參考基因組DM中鑒定出25個(gè)OFP基因，將其命名為StOFP1-StOFP25，其中StOFP20的編碼基因是PGSC0003DMC400010028.DM是長形薯形，基因組中不含有與SlOFP20相似的基因，且PGSC0003DMC400010028在進(jìn)化樹上也沒有與SlOFP20聚為一類[13].因此，將PGSC0003DMC400010028命名為StOFP20是不恰當(dāng)?shù)?

Wu等利用長形薯形的DM和圓形薯形的M6雜交群體，將Ro薯形位點(diǎn)定位到M6中包含有StOFP20的區(qū)間[10].由于在DM中StOFP20是缺失的，馬鈴薯公共數(shù)據(jù)庫只提供了M6的基因組序列，Wu等的文章中也沒有提供StOFP20的編碼序列，因此StOFP20的完整編碼序列是未知的.本文利用薯形分離的151自交群體，將Ro位點(diǎn)定位到298 kb內(nèi)，并利用SlOFP20的序列進(jìn)行比對(duì)，克隆了StOFP20.該基因可以在圓形薯形中擴(kuò)增出來，但在橢圓形薯形的植株中不能擴(kuò)增出來，與Wu等的研究結(jié)果一致[10].此外，作為標(biāo)記能否擴(kuò)增出來在實(shí)際操作過程中很難鑒定，如實(shí)驗(yàn)過程中的DNA質(zhì)量和PCR過程失誤都有可能導(dǎo)致擴(kuò)增不出來，因此本研究提供的InDel標(biāo)記能夠清楚地區(qū)分圓形和橢圓形(長形)塊莖，有利于將分子標(biāo)記應(yīng)用于薯形的早期選擇.

番茄果實(shí)和馬鈴薯塊莖的形成機(jī)制是完全不同的，番茄果實(shí)是子房受精膨大形成的，塊莖是地下匍匐莖膨大形成的，OFP20可以調(diào)控馬鈴薯塊莖和番茄果實(shí)的形狀，由此可見OFP20的作用機(jī)制是保守的.番茄SlOFP20調(diào)節(jié)果實(shí)形狀的機(jī)制可能是OFP20與TRM(TONNEAU1 Recruiting Motif)蛋白復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)和微管的動(dòng)態(tài)定位調(diào)控了細(xì)胞分裂，進(jìn)而影響了番茄果實(shí)形狀[10].在馬鈴薯中，OFP20是否與TRM互作共同調(diào)控塊莖形狀還需進(jìn)一步研究.