乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉*

段思凡， 唐飛， 楊慧芹， 楊玉玲， 馬玲

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上繼水稻和小麥后的第三大糧食作物[1-2].馬鈴薯塊莖中淀粉含量在植物淀粉中位居第二位[3]，淀粉是構(gòu)成馬鈴薯塊莖干物質(zhì)的主要成分.馬鈴薯淀粉具有粉質(zhì)白凈、黏度高、糊化溫度低及支鏈淀粉含量高等特點(diǎn)[4]，因此目前市場(chǎng)上馬鈴薯淀粉的消費(fèi)量?jī)H次于玉米淀粉[5]，被廣泛應(yīng)用于食品、化工、紡織、醫(yī)藥和飼料等行業(yè)，具有巨大的商業(yè)價(jià)值[6].我國(guó)馬鈴薯加工業(yè)中存在淀粉提取率低和品質(zhì)不良等方面的不足，制約了我國(guó)馬鈴薯淀粉加工業(yè)的發(fā)展.

關(guān)于植物淀粉的提取方法國(guó)內(nèi)外已有相應(yīng)的報(bào)道，主要的提取方法有酸液浸泡法[7]、表面活性劑法、酶提法[4,8-9]、超聲波輔助提取[10]、水提法[11-12]和堿提法[13-14]等.許力等[15]研究了實(shí)驗(yàn)室馬鈴薯淀粉提取工藝及其影響因素，王國(guó)扣[16]研究了影響馬鈴薯淀粉提取率的主要因素，認(rèn)為淀粉提取率不僅與工藝條件有關(guān)，而且與馬鈴薯淀粉含量有關(guān)；陳立勝等[17]研究了粉碎方法對(duì)淀粉提取率的影響.

以上提取方法主要針對(duì)傳統(tǒng)四倍體栽培種馬鈴薯，二倍體馬鈴薯與四倍體馬鈴薯相比，其淀粉含量、直鏈淀粉含量及淀粉顆粒特性等方面均存在明顯差異.已有的淀粉提取方法在提取二倍體馬鈴薯淀粉時(shí)存在成本高且效率低等弊端.為了探索二倍體馬鈴薯淀粉的提取工藝，參考文獻(xiàn)方法[18-20]，對(duì)乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉工藝條件及淀粉顆粒進(jìn)行了研究，以期縮減大批量淀粉提取測(cè)定的時(shí)間與工作量，為在淀粉工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從國(guó)際馬鈴薯中心引入的二倍體馬鈴薯材料C系列編號(hào)的組培苗，擴(kuò)繁后，于2019年3月種植于云南省昆明市尋甸縣六哨鄉(xiāng)，7月收獲薯塊.從中挑選無(wú)病害、無(wú)發(fā)芽且無(wú)腐爛的新鮮薯塊用于優(yōu)化二倍體馬鈴薯的淀粉提取工藝；馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品S11003(上海源葉生物科技有限公司)，碘化鉀(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碘(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鉀(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，95%乙醇(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(coolsafe 110-4型,丹麥Labogene公司)，酶標(biāo)儀(VersaMax型,Molecular Devices公司)，pH計(jì)(S220-K型,上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)，磁力攪拌器(MYP11-2型,上海右一儀器有限公司)，電子分析天平(JD200-3型,沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-bx43f型,南京貝登電子商務(wù)有限公司)，組織破碎儀(DS-1型,上海右一儀器有限公司)，榨汁機(jī)(WJE2802D型,Midea公司).

1.3 方法

1.3.1 乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉

按照新鮮二倍體馬鈴薯→清洗→破碎→汁渣分離→乙醇沉降→干燥→淀粉成品的技術(shù)流程，進(jìn)行二倍體馬鈴薯淀粉的提取.具體的操作如下：將二倍體馬鈴薯鮮薯洗凈削皮切塊混勻后稱重，記錄.利用組織破碎儀對(duì)塊莖進(jìn)行頻率為50 Hz的組織破碎5 min，塊莖初步破碎后轉(zhuǎn)入榨汁機(jī)進(jìn)行汁渣分離處理，收集汁液.所得的粗渣用50 mL蒸餾水進(jìn)行2遍濾洗得到濾洗液.將濾洗液和收集的汁液進(jìn)行混合，得到淀粉粗提液.調(diào)節(jié)淀粉粗提液的pH至6.0，靜置10 min后加入95%乙醇加速淀粉沉淀.棄上清液，沉淀即為淀粉，濕淀粉用20 mL蒸餾水進(jìn)行洗滌，共洗滌三次，棄洗液.洗滌完后將淀粉沉淀置于-80 ℃冰箱12 h后，對(duì)濕淀粉進(jìn)行冷凍干燥處理48 h，獲得淀粉制品.

1.3.2 乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉單因素試驗(yàn)

鮮薯重量、乙醇終濃度和蒸餾水洗滌次數(shù)影響了二倍體馬鈴薯淀粉的提取率.對(duì)鮮薯重量、乙醇終濃度和蒸餾水洗滌次數(shù)分別設(shè)置三個(gè)參數(shù)，按照1.3.1中列出的二倍體馬鈴薯淀粉提取方法，分別確定淀粉提取率的最佳參數(shù).

1.3.3 淀粉提取正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定上述三個(gè)因素的最佳參數(shù)后，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行3因素3水平L9正交試驗(yàn).見(jiàn)表1，確定乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉的最佳工藝參數(shù).

根據(jù)二倍體馬鈴薯淀粉性質(zhì)與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇終濃度(A)、鮮薯重量(B)和洗滌次數(shù)(C)三個(gè)因素，分別設(shè)立三個(gè)水平，利用L9正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取二倍體馬鈴薯淀粉的工藝參數(shù).

表1 L9因素水平

1.3.4 直鏈淀粉含量的測(cè)定

采用雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定直鏈淀粉含量[18,21-24].

樣品直鏈淀粉含量的測(cè)定：稱取樣品0.100 0 g至50 mL離心管中，加入10 mL 0.5 mol/L KOH，沸水浴20 min混勻反應(yīng)，雙蒸水50 mL進(jìn)行定容.吸取定容后的樣品液2.5 mL至新的50 mL離心管中，加入雙蒸水25 mL混勻，0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.5，加入0.5 mL的碘—碘化鉀，雙蒸水定容至50 mL刻度線.定容后的混合液常溫靜置25 min(三次重復(fù)).每一個(gè)編號(hào)取反應(yīng)液250 μL重復(fù)于96孔微型板中，進(jìn)行雙波長(zhǎng)535～570 nm的測(cè)定(三次重復(fù)求平均值)，利用公式計(jì)算出直鏈淀粉含量的百分比.

W：直鏈淀粉含量/%；M為樣品質(zhì)量/g；X為淀粉含水量/g；10為單位換算系數(shù)，A570nm為570 nm波長(zhǎng)處混合液的吸光度值，A535nm為534 nm波長(zhǎng)處混合液的吸光度值.

1.3.5 淀粉顆粒的觀察

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)與碘-碘化鉀結(jié)合的淀粉顆粒進(jìn)行形態(tài)大小觀察.將二倍體馬鈴薯淀粉樣品0.1 g與1 mL雙蒸水混合調(diào)成淀粉乳，取一滴淀粉乳滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡的載物臺(tái)，選擇適宜的光亮度，在10×的目鏡及20×和40×的物鏡下進(jìn)行觀察并拍照.

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0和Excel進(jìn)行處理及分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

2.1.1 乙醇終濃度對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

為確定乙醇終濃度對(duì)淀粉提取率的影響，稱取50 g去皮清洗干凈的新鮮二倍體馬鈴薯薯塊按1.3.1的提取工藝進(jìn)行提取.將蒸餾水洗滌次數(shù)設(shè)置為3次,分別計(jì)算不同乙醇終濃度條件下，二倍體馬鈴薯淀粉提取率的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1.可以看出隨著淀粉粗提取液中乙醇終濃度的增加，淀粉提取率增高，但是超過(guò)30%后，淀粉提取率快速降低，乙醇終濃度為30%時(shí)，獲得的淀粉提取率較高.

圖1 不同乙醇終濃度對(duì)淀粉提取率的影響

2.1.2 鮮薯重量對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

為了確定鮮薯重量對(duì)淀粉提取率的影響，在乙醇終濃度為30%，蒸餾水洗滌次數(shù)設(shè)置為3次的前提下，考察鮮薯重量分別為30、40 g和50 g時(shí)，二倍體馬鈴薯淀粉提取率的變化.結(jié)果見(jiàn)圖2，二倍體馬鈴薯淀粉的提取率隨著薯塊鮮重的減少，緩慢降低，當(dāng)二倍體馬鈴薯鮮重為50 g時(shí)，淀粉的提取率最高.

圖2 不同鮮薯重對(duì)淀粉提取率的影響

Fig.2 Influence of different fresh potato weights on starch yield

2.1.3 淀粉洗滌次數(shù)對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

為了確定蒸餾水洗滌次數(shù)對(duì)淀粉提取率的影響，在鮮薯重量為50 g，乙醇終濃度為30%的前提下，考察不同洗滌次數(shù)對(duì)淀粉提取率的影響.如圖3所示，隨著蒸餾水洗滌次數(shù)的增高，淀粉提取率顯著降低，因此為了獲得最高的二倍體馬鈴薯淀粉提取率，蒸餾水的洗滌次數(shù)應(yīng)為3次.

圖3 不同洗滌次數(shù)對(duì)淀粉提取率的影響

Fig.3 Influence of different washing times on starch yield

2.2 二倍體馬鈴薯淀粉提取工藝影響因素的優(yōu)化研究

為了確定乙醇終濃度、鮮薯重量和蒸餾水洗滌次數(shù)這三個(gè)因素之間對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉提取率是否存在相互影響，并確定乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉的最適提取參數(shù)，設(shè)計(jì)了三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示.其中A因素代表乙醇終濃度，分別設(shè)置為20%、30%和50%；B因素代表用于提取淀粉的鮮薯重量，設(shè)置30、40 g和50 g三個(gè)參數(shù)；C因素代表淀粉提取過(guò)程中，蒸餾水的洗滌次數(shù)，分別設(shè)置3、4次和5次.通過(guò)對(duì)淀粉提取率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)，得出淀粉提取率的最佳條件組合為A2B2C1.即乙醇終濃度為30%，鮮薯重為50 g，洗滌次數(shù)為3次時(shí)，二倍體馬鈴薯淀粉提取率為10.94%.從極差R的大小可見(jiàn)，各因素對(duì)淀粉提取的影響作用順序?yàn)橐掖冀K濃度>洗滌次數(shù)>鮮薯重量.

表2 正交實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表3可知，乙醇終濃度的F=396.94，P=0.003<0.01，差異極顯著；鮮重的F=75.43，P=0.013<0.05，差異顯著；洗滌次數(shù)的F=89.07，P=0.011<0.05，差異顯著.F檢驗(yàn)結(jié)果表明，二倍體馬鈴薯淀粉在提取過(guò)程中，乙醇終濃度、鮮重及洗滌次數(shù)三個(gè)因素均對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉提取率有顯著影響.

表3 淀粉提取率方差分析

a:R2= 0.998

2.3 馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)與大小

不同馬鈴薯的淀粉顆粒形態(tài)差異可通過(guò)染色后在光學(xué)顯微鏡下清晰辨別.馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)上大多數(shù)為橢圓形，大小范圍在20～100 μm[25-26].不同植物來(lái)源的淀粉顆粒因其遺傳性和生長(zhǎng)環(huán)境條件的差異而具有不同的大小、形狀(球形、橢圓形、多面體和不規(guī)則形)及粒徑分布[27].

在光學(xué)顯微鏡下，觀察四倍體和二倍體馬鈴薯的淀粉顆粒，如圖4所示，淀粉顆粒經(jīng)碘-碘化鉀染液染色后呈藍(lán)紫色，二倍體馬鈴薯的淀粉顆粒相比于四倍體，其顆粒分布更為松散，直徑較小，且不規(guī)則形狀的淀粉顆粒比例增高.

A:200×放大倍數(shù)下四倍體馬鈴薯淀粉顆粒;B:200×放大倍數(shù)下二倍體馬鈴薯淀粉顆粒;C:400×放大倍數(shù)下四倍體馬鈴薯淀粉顆粒;D:400×放大倍數(shù)下二倍體馬鈴薯淀粉顆粒

圖4 光學(xué)顯微鏡下淀粉顆粒的形態(tài)與大小

Fig.4 Morphology and size of starch granules under optical microscope

3 討 論

馬鈴薯淀粉深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)是提高馬鈴薯在產(chǎn)業(yè)鏈中價(jià)值的重要環(huán)節(jié)，建立有效的淀粉提取工藝對(duì)于發(fā)展馬鈴薯淀粉產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要.對(duì)馬鈴薯淀粉提取工藝的研究一直是工業(yè)研究的熱點(diǎn)，王大為[10]、許力[15]及陳立勝[17]等人研究了馬鈴薯淀粉的提取工藝及其影響因素，但未對(duì)提取到的馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)做進(jìn)一步觀察.淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)形態(tài)是研究淀粉加工性能的基礎(chǔ)，淀粉顆粒的差異影響著淀粉的加工[28].因此，提高淀粉提取效率的同時(shí)也要注重觀察淀粉顆粒的形態(tài)變化.傳統(tǒng)的馬鈴薯淀粉提取工藝主要針對(duì)四倍體馬鈴薯，且易造成淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生改變.研究采用乙醇沉淀法進(jìn)行二倍體馬鈴薯淀粉的提取，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9確定乙醇沉淀法的三個(gè)工藝參數(shù)(乙醇終濃度、鮮薯重量和洗滌次數(shù))的最優(yōu)條件組合.采用乙醇沉淀法提取的淀粉顆粒經(jīng)碘染后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒的形態(tài)正常，無(wú)破損，說(shuō)明乙醇沉淀法具有穩(wěn)定淀粉顆粒形態(tài)的優(yōu)點(diǎn).

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合具有代表性的9組試驗(yàn)進(jìn)行分析，得出乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉的最佳工藝參數(shù)組合為：乙醇終濃度為30%，鮮薯重為50 g，洗滌次數(shù)為3次.乙醇終濃度的高低對(duì)淀粉提取率影響較大.適宜的乙醇終濃度能夠提高二倍體馬鈴薯淀粉的提取效率，材料重量對(duì)淀粉提取率具有一定的影響；利用碘-碘化鉀染色法對(duì)不同倍性馬鈴薯顆粒進(jìn)行觀察，淀粉顆粒形態(tài)正常無(wú)破損，二倍體馬鈴薯淀粉顆粒與四倍體馬鈴薯淀粉顆粒相比直徑較小.

綜上所述，研究篩選出了適合二倍體馬鈴薯淀粉提取的最適乙醇終濃度、鮮薯重量及洗滌次數(shù)，并發(fā)現(xiàn)二倍體馬鈴薯淀粉顆粒與四倍體的相比存在明顯區(qū)別，研究結(jié)果可為針對(duì)二倍體馬鈴薯淀粉的生物學(xué)研究提供有益參考.