滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在鼻咽癌中的表達(dá)及與其臨床病理特征的相關(guān)性分析

李志偉，繆 琴，王 為

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是一種發(fā)生于鼻咽部的惡性腫瘤，是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一[1]。在NPC疾病初期，患者癥狀均較輕且常見，故未引起重視，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展至疾病中晚期[2]。目前臨床上常通過CT及核磁共振成像(MRI)等檢查對(duì)NPC患者的病情分期及治療進(jìn)行有效評(píng)估。放療是臨床上針對(duì)NPC的首選治療方法，可有效控制其病情，但仍有少數(shù)患者治療后再復(fù)發(fā)甚至發(fā)生惡化轉(zhuǎn)移，故對(duì)NPC發(fā)生及病變過程中患者體內(nèi)相關(guān)生物分子表達(dá)情況進(jìn)行研究于患者預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義[3]。滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen 2, Trop2)是一種存在于細(xì)胞表面的糖蛋白，對(duì)惡性腫瘤的遷移與侵襲具有調(diào)控作用[4]。而DNA甲基化在全身各類細(xì)胞發(fā)育過程中也具有積極作用，其中最為常見且發(fā)揮作用的就是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA Methyltransferase 1, DNMT1)[5]。目前臨床上對(duì)于Trop2與DNA甲基化對(duì)NPC病變過程的影響的研究較為少見[6]。本研究通過對(duì)本院確診131例NPC患者的臨床資料進(jìn)行探究，分析Trop2、DNMT1的表達(dá)與該類患者臨床病理特征的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析我院2014年5月—2019年5月收治的131例NPC患者的臨床資料，男96例，女35例；年齡22～64(42.38±7.26)歲。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期86例。 ①納入標(biāo)準(zhǔn)：符合NPC診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)病理檢查結(jié)果證實(shí)[7]；術(shù)前未行抗癌輔助治療；患者對(duì)本研究知情,并簽署同意書。 ②排除標(biāo)準(zhǔn)：伴嚴(yán)重系統(tǒng)性疾??；合并全身其他類型惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，臨床資料均完整。

1.2儀器與試劑 10%甲醛溶液、石蠟、Trazol溶液(日本Takara公司)、PCR儀(美國(guó)ABI-7500 Real-Time PCR)、通用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)試劑盒、兔抗人Trop2多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、羊抗人DAMT1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、經(jīng)HRP標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔抗體(美國(guó)Earthox公司)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1Trop2表達(dá)水平檢測(cè)：取患者鼻咽部黏膜組織，在30 min內(nèi)將黏膜組織置于10%甲醛溶液中固定浸泡，石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇予以脫水，并使用枸櫞酸鹽修復(fù)液對(duì)組織進(jìn)行3 min的高壓修復(fù)，修復(fù)完成后用免疫組化筆在受檢組織1～2 mm外劃圈，再加入3% H2O2放置于恒溫箱中孵育20 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶干擾，并運(yùn)用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，漂洗3次后加入適量的10%正常羊血清于室溫下密閉15 min，棄血清，并以1∶500的稀釋比例滴加兔抗人Trop2多克隆抗體放置于4℃的恒溫箱中過夜，再用PBS漂洗3次，并予以DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。各組標(biāo)本均將PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以自身對(duì)照作為陽性對(duì)照。

1.3.2DNMT1表達(dá)水平檢測(cè)：取患者鼻咽部黏膜組織，由相關(guān)專業(yè)人員用Trazol溶液將黏膜組織樣本和總RNA進(jìn)行提取，并嚴(yán)格按照試劑盒說明合成cRNA。設(shè)計(jì)DNMT1引物，DNMT1上游序列5'-GATGATTCCTCAAAACCGCTGTA-3'；下游序列5'-GTAGGTCTTCCCGTCGTCCC-3'。合成完畢后取所有患者的cDNA 5 μl，將其作為模板，再分別加入至2 μl 10×buffer和4 μl H2O中，并經(jīng)過高溫變性、循環(huán)，再進(jìn)行PCR儀檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，參考DL 2000 marker分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行紫外凝膠掃描成像，該樣本的表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度則為與樣本內(nèi)對(duì)照β-actin的熒光強(qiáng)度比值。所有操作均嚴(yán)格遵循說明書要求執(zhí)行。

1.4Trop2及DNMT1蛋白免疫組織學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行判定：由兩位病理科醫(yī)生在400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野對(duì)染色細(xì)胞數(shù)量和染色程度進(jìn)行評(píng)分。①陽性細(xì)胞數(shù)量：<1%為0分，1%～10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。②染色程度：無染色為0分，弱陽性顯黃色為1分，中等陽性顯淺棕色為2分，強(qiáng)陽性顯棕褐色為3分，并將二者所得分?jǐn)?shù)合計(jì)，0～3分為無表達(dá)或低表達(dá)，4～6分為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1NPC患者癌組織和癌旁組織的Trop2及DNMT1蛋白表達(dá)水平比較 NPC患者鼻咽組織Trop2、DNMT1陽性表達(dá)于細(xì)胞膜上，于其細(xì)胞膜處可見較多的棕色顆粒。見圖1。NPC組織的Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

圖1 NPC癌組織中DNMT1和Trop2蛋白表達(dá)(SP×100)

A. DNMT1蛋白表達(dá)；B. Trop2蛋白表達(dá)；NPC為鼻咽癌，DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，Trop2為滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2

表1 Trop2及DNMT1蛋白在NPC癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平比較[例(%)]

注：NPC為鼻咽癌，Trop2為滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2，DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1；與癌旁組織比較，bP<0.01

2.2NPC癌組織中Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 NPC癌組織中Trop2、DNMT1的蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NPC患者TNM分期處于Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Trop2、DNMT1的蛋白表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 NPC癌組織中Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

注：NPC為鼻咽癌，Trop2為滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2，DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1

2.3NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 NPC患者Trop2、DNMT1的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析

注：NPC為鼻咽癌，Trop2為滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2，DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1

3 討論

NPC是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，好發(fā)于南方各省，發(fā)病具有明顯的種族、家族和地區(qū)聚集現(xiàn)象[9]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全世界80%的NPC發(fā)生在我國(guó)，多見于30～50歲的患者，男∶女為2～3∶1[10]。NPC患者常出現(xiàn)鼻塞、涕中帶血、頭暈頭痛、聽力下降、耳鳴以及復(fù)視等癥狀，且老年人和年輕人均有可能發(fā)生，對(duì)人們的健康造成了嚴(yán)重影響[11]。NPC早期患者5年生存率可達(dá)70%以上;若疾病惡化發(fā)展至晚期，5年生存率僅為8%～10%，故該疾病的發(fā)病機(jī)制及病理分期可影響患者后續(xù)治療及生活質(zhì)量[12]。

大多數(shù)學(xué)者均認(rèn)為NPC的發(fā)病與EB病毒感染、吸煙、遺傳及環(huán)境因素有關(guān)；然而近年來有相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化及滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原在NPC發(fā)病的過程中具有重要意義[13-14]。DNA甲基化對(duì)胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化及基因調(diào)解具有重要作用，若DNA甲基化發(fā)生異?？蓪?dǎo)致正?；蚬δ苤袛嗖⒁l(fā)各類疾病[15-16]。不同形式的異常DNA甲基化常發(fā)生于惡性腫瘤患者機(jī)體中:發(fā)生某些基因和重復(fù)序列的高度甲基化、抑癌基因的高度甲基化及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)表達(dá)異常等[17]。DNMT是調(diào)節(jié)DNA甲基化的關(guān)鍵因子之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，存在于人體中且具有活性的DNMTs僅有3個(gè):DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，且不同的DNMT在腫瘤組織中表達(dá)水平不均一[18]。有報(bào)道稱DNMT1和DNMT3b在胃癌中呈高表達(dá)水平，在一定程度上誘導(dǎo)了DNA甲基化[19]。Trop2是一種在滋養(yǎng)層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白[20]。有相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Trop2在健康機(jī)體的表達(dá)較低，而廣泛表達(dá)于大量腫瘤患者機(jī)體中，且與腫瘤的性質(zhì)、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度等存在密切聯(lián)系[21]。本研究中結(jié)果顯示，Trop2、DNMT1蛋白在NPC癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且明顯高于癌旁組織；伴隨有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期處于Ⅲ～Ⅳ期的NPC患者的Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平更高。這有效的驗(yàn)證了上述研究的說法，而在臨床上，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC晚期患者預(yù)后較差，這也在一定程度上說明了，Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平與該疾病的預(yù)后具有一定的相關(guān)性。本研究對(duì)NPC患者Trop2、DNMT1表達(dá)水平與病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)，與陳順金等[22]及劉宇軒[23]研究結(jié)果一致。

綜上所述，NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)水平與其病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性。臨床治療上可根據(jù)Trop2、DNMT1蛋白表達(dá)情況對(duì)患者病情評(píng)估與治療指導(dǎo)，可通過有效抑制DNMT1、Trop2的表達(dá)來抑制惡性腫瘤的發(fā)生。