丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射液對(duì)內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷及ERK1/2-NF-κB通路的影響

李曉峰，李英杰，佟 凱

內(nèi)毒素是急性肺損傷進(jìn)展的重要誘因，通過抑制中性粒細(xì)胞積聚，阻礙介質(zhì)釋放，減緩血小板聚集，抑制髓過氧化物酶及中性粒細(xì)胞胞外陷阱活性而加劇急性肺損傷[1-3]。脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子積累，擴(kuò)增急性肺炎[4]核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及MAPK家族成員ERK1/2是促炎基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。研究表明，LPS與Toll樣受體4的結(jié)合導(dǎo)致NF-κ B 的抑制蛋白IκB-α磷酸化和降解，激活磷酸化ERK1/2及NF-κB，并且導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6等促炎介質(zhì)釋放[5]。

丙泊酚為烷基酸類的短效靜脈麻醉藥[6],能使顱內(nèi)壓降低、腦耗氧量及腦血流量減少。熱毒寧注射液可抑制TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中p38絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化和NF-κB的激活[7-8]。本研究探討了丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射液對(duì)內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷及ERK1/2-NF-κB通路的影響，旨在為急性肺損傷的治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒 選取Sprague-Dawley大鼠100只，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8周齡，體重(200.3±20.1)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉) 2017-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(吉) 2017-0013，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20180375。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜循環(huán)(12/12 h)，室溫(22±1)℃。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組，每組20只，雌雄各半。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 丙泊酚注射液(Fresenius Kabi AB公司，批號(hào)：625474)，熱毒寧注射液(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20180319)；大腸桿菌055∶B5的LPS(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：S54742)；IL-2、IL-6、TNF-α試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，批號(hào)：KIT415987、KIT254987、KIT148965)；ERK1/2、NF-κB一抗、辣根過氧化物酶綴合的抗人二抗(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：SC0617、SC0639、SC0826)；ERK1/2、NF-κB多克隆抗體探測(cè)膜(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab65137、ab63157)；Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒、高容量RNA-to-cDNA試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，批號(hào)：180423]；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：C7349)；RIPA緩沖液(美國(guó)賽默飛世爾公司，批號(hào)：45965)；10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠、聚偏二氟乙烯膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：56987、54155)；ABI PRISM 7900序列檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)；HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(中國(guó)成都泰盟科技有限公司)；BU-90Odyssey紅外線成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)；XU-8化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)；VC-JN12凝膠圖像處理系統(tǒng)(美國(guó)熱電公司)。

1.3動(dòng)物模型的制備 模型組、丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，各組大鼠通過腹腔內(nèi)注射來自大腸桿菌055∶B5的LPS 10 mg/kg誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型。大鼠麻醉蘇醒后口唇灰紫，精神萎靡，皮毛聳立說明急性肺損傷模型建立成功[9]。丙泊酚組大鼠腹腔注射丙泊酚注射液50.0 mg/kg，熱毒寧組大鼠腹腔注射熱毒寧注射液50.0 mg/kg，聯(lián)合組大鼠腹腔注射丙泊酚50.0 mg/kg和熱毒寧注射液50.0 mg/kg；對(duì)照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，均持續(xù)給藥7 d。

1.4肺/體重測(cè)定及肺損傷評(píng)估 第7天頸椎脫臼處死大鼠后取右肺組織，測(cè)定大鼠濕肺/體重；隨后取右肺部分組織進(jìn)行常規(guī)染色切片，并在顯微鏡下閱片，根據(jù)肺泡內(nèi)充血、肺間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡水腫進(jìn)行評(píng)分：極重度改變?yōu)?分、重度改變?yōu)?分、中度改變?yōu)?分、輕度改變?yōu)?分、無改變或非常輕微改變?yōu)?分，累計(jì)上述4項(xiàng)的總分即為肺損傷評(píng)分。

1.5各組大鼠肺組織ERK1/2和NF-κB mRNA表達(dá)水平 采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒在ABI PRISM 7900序列檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)擴(kuò)增。用Trizol試劑根據(jù)制造商的方案提取大鼠肺組織總RNA。使用500 ng RNA及高容量RNA-to-cDNA試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。ERK1/2 mRNA的引物序列如下：正向：5'GCCTCCTCAAAAGAGAGTGGAAG3'，反向：5'TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG3'。NF-κB mRNA的引物序列：正向：5'GCCGTGAGAAGCTTTCCACTC3'，反向：5'TTAAGGTTGGCTTCAGGCTCAA3'。GAPDH正向：5'ACGGATTTGGTCGTATTGGG3'，反向：5'TGATTTTGGAGGGATCTCGC3'。將ERK1/2和NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA，1 μl；雙蒸水，3.4 μl；提示綠色qPCR SuperMix，5 μl；被動(dòng)參比染料(×50)，0.2 μl；正向引物(10 μmol/L)，0.2 μL；反向引物(10 μmol/L)，0.2 μl。系統(tǒng)的總體積為10 μl。在所有40個(gè)循環(huán)中，反應(yīng)條件首先是95℃持續(xù)35 s，最后是60℃持續(xù)30 s。同時(shí)，構(gòu)建了65℃～95℃的溶解度曲線，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和比較定量閾值循環(huán)(ΔΔCt)方法。

1.6各組大鼠肺組織ERK1/2和NF-κB蛋白表達(dá)水平 PAB處理肺組織勻漿24 h后，用RIPA緩沖液收集肺組織勻漿裂解物，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，然后電化學(xué)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用針對(duì)鼠ERK1/2、NF-κB(1∶1000稀釋)、鼠多克隆抗體探測(cè)膜(1∶1000稀釋)、(ERK1/2)/GAPDH(1∶1000)、NF-κB/GAPDH(1∶1000)抗體在4℃下過夜。在與辣根過氧化物酶綴合的抗人二抗(1∶5000)在室溫下孵育1 h后，通過使用BU-90Odyssey紅外成像系統(tǒng)顯現(xiàn)印跡。在同一膜上檢測(cè)β-actin用作上樣對(duì)照，用XU-8化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)條帶并通過VC-JN12凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，將蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)于β-actin標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7各組大鼠肺組織IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平 稱取大鼠右肺組織，制成勻漿，收集上清液，ELISA法檢測(cè)IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.15組大鼠肺/體比值、肺損傷評(píng)分比較 與對(duì)照組比較，模型組肺/體比值、肺損傷評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組肺/體比值、肺損傷評(píng)分顯著降低，且聯(lián)合組肺/體比值、肺損傷評(píng)分低于丙泊酚組和熱毒寧組(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠肺/體比值、肺損傷評(píng)分比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與丙泊酚組比較，eP<0.05；與熱毒寧組比較，gP<0.05

2.25組大鼠右肺組織形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組未見顯著肺泡破化，無中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，無膠原蛋白沉淀。模型組肺泡嚴(yán)重破化，肺泡壁顯著增厚，較多膠原蛋白沉淀于肺間質(zhì)，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著。丙泊酚組、熱毒寧組肺泡破壞程度較模型組輕，有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。聯(lián)合組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，幾乎無膠原蛋白沉淀。見圖1。

圖1 5組大鼠右肺組織病理形態(tài)(HE×400)

A.對(duì)照組；B.模型組；C.丙泊酚組；D.熱毒寧組；E.聯(lián)合組

2.35組大鼠肺ERK1/2和NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組ERK1/2和NF-κB mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組ERK1/2和NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著降低，且聯(lián)合組低于丙泊酚組和熱毒寧組(P<0.05)。見表2。

2.45組大鼠肺ERK1/2和NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組ERK1/2和NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組ERK1/2和NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著降低，且聯(lián)合組低于丙泊酚組和熱毒寧組(P<0.05)。見表3和圖2。

2.55組大鼠肺IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低,聯(lián)合組低于丙泊酚組和熱毒寧組(P<0.05)。見表4。

3 討論

急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是重癥監(jiān)護(hù)中患者死亡發(fā)生的主要原因。ARDS由促炎細(xì)胞因子的釋放、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向肺內(nèi)的募集引起，導(dǎo)致肺血管通透性增加。目前，ARDS唯一有效的治療方法是保護(hù)性機(jī)械通氣；因此，迫切需要開發(fā)用于治療ARDS的藥物。既往文獻(xiàn)報(bào)道，熱毒寧注射液可降低卵清蛋白致敏哮喘小鼠血清的IL-6和TNF-α水平；熱毒寧注射液也具有抗氧化特性，可抑制大鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注誘導(dǎo)的抗氧化蛋白超氧化物歧化酶-2和硫氧還蛋白的表達(dá)[10-11]。在缺氧/再氧合誘導(dǎo)的新生兒心肌細(xì)胞損傷中，熱毒寧注射液通過降低脂質(zhì)過氧化和增強(qiáng)抗氧化活性來保護(hù)心肌細(xì)胞[12]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肺/體比值、肺損傷評(píng)分顯著升高；與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組肺/體比值、肺損傷評(píng)分顯著降低，且聯(lián)合組上述指標(biāo)低于丙泊酚組和熱毒寧組；這提示丙泊酚、熱毒寧注射液均可減輕內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷，且丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射液時(shí)效果更好。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，丙泊酚組、熱毒寧組肺泡破壞程度較模型組輕，有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；聯(lián)合組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，幾乎無膠原蛋白沉淀；這說明，丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射可減輕內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

過量炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6的產(chǎn)生在急性肺損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而，TNF-α和IL-6基因的表達(dá)依賴于轉(zhuǎn)錄的激活。ERK1/2包含一系列轉(zhuǎn)錄因子，其作為促炎介質(zhì)的調(diào)節(jié)劑具有重要作用；ERK1/2的激活需要抑制蛋白ERK1/2-α的磷酸化水解，抑制ERK1/2-α2的激活可有效抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)[13-14]。NF-κB家族包括p65(RelA)、p50/p105(NF-κB1)、p52/p100(NF-κB2)、RelB和c-Rel，在細(xì)胞質(zhì)中作為同源二聚體或異二聚體存在，并通過結(jié)合維持無活性狀態(tài)到IκB蛋白。在LPS或促炎細(xì)胞因子刺激后，IκB蛋白通過激活I(lǐng)κB激酶而被磷酸化并降解，導(dǎo)致活化，然后NF-κB易位到細(xì)胞核中，從而上調(diào)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄[15-17]。NF-κB的激活是動(dòng)物內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性非損傷發(fā)展的關(guān)鍵。在一項(xiàng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(ACEⅡ)對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺損傷實(shí)驗(yàn)中，大鼠肺過表達(dá)ACEⅡ可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2-NF-κB磷酸化和增強(qiáng)IκBα表達(dá)，這一結(jié)果可由ACEⅡ抑制劑完全逆轉(zhuǎn)[18]；與ACEⅡ過表達(dá)相反，沉默ACEⅡ顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NF-κBp50/p65活化和IκBα降解。表明抑制ERK1/2-NF-κB炎癥通路對(duì)于LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組ERK1/2和NF-κB mRNA、ERK1/2和NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著升高；與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組ERK1/2和NF-κB 的mRNA表達(dá)水平、ERK1/2和NF-κB 的蛋白表達(dá)水平明顯降低，且聯(lián)合組低于丙泊酚組、熱毒寧組。說明丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射液可抑制ERK1/2和NF-κB mRNA表達(dá)水平、ERK1/2和NF-κB蛋白表達(dá)水平，從而抑制內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)。本研究同時(shí)探討了丙泊酚、熱毒寧注射液對(duì)于ERK1/2、NF-κB信號(hào)通路下游炎性因子的影響。結(jié)果表明，與模型組比較，丙泊酚組、熱毒寧組、聯(lián)合組IL-2、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯降低，且聯(lián)合組低于丙泊酚組、熱毒寧組。與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表2 5組大鼠肺ERK1/2和NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

注：NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子-κB;與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與丙泊酚組比較，eP<0.05；與熱毒寧組比較，gP<0.05

表3 5組大鼠肺ERK1/2和NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

注： NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子-κB;與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與丙泊酚組比較，eP<0.05；與熱毒寧組比較，gP<0.05

圖2 5組大鼠肺ERK1/2、NF-κB 蛋白表達(dá)情況

A.對(duì)照組；B.模型組；C.丙泊酚組；D.熱毒寧組；E.聯(lián)合組；NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子-κB

表4 5組大鼠肺IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

注：IL-2為白介素-2，IL-6為白介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與丙泊酚組比較，eP<0.05；與熱毒寧組比較，gP<0.05

綜上所述，丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射液可減輕內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)；其機(jī)制與丙泊酚聯(lián)合熱毒寧注射液抑制ERK1/2-NF-κB通路基因蛋白及其下游炎性因子的表達(dá)有關(guān)。