苦瓜皂甙的提取及其對(duì)胰脂肪酶抑制活性的研究

周巧杰，吳子健，*，胡佩卿，侯惠靜

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.廣東寶萊特醫(yī)用科技股份有限公司，天津300134；3.天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津301700）

目前常用的減肥藥是通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)來抑制人體的食欲，但會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害[1-3]，而植物源的皂甙、多酚以及三萜類化合物會(huì)通過降低甚至是抑制脂肪酶的活力[4-5]，使得脂肪在進(jìn)入機(jī)體后無法得到有效的分解，脂肪在胃腸道內(nèi)無法得到吸收，是目前比較有效的一種減肥的手段[6-8]，諸如：2006年Kimura H等發(fā)現(xiàn)七葉樹種子皂苷混合物可強(qiáng)烈抑制胰脂肪酶的活性[9]；2008年Hu J等的研究進(jìn)一步證明七葉樹種子的總皂甙混合物能有效降低機(jī)體對(duì)于脂肪的吸收，從而抑制喂食高脂肪食物小鼠的體重、機(jī)體脂肪含量以及肝臟脂肪含量的增加[10-11]；Zheng Q等發(fā)現(xiàn)從絲石竹根部提取出的皂甙混合物能有效抑制了胰脂肪酶活性，絲石竹根部皂甙混合物對(duì)于脂肪酶IC50值為0.54 mg/mL[12]；Karu N等發(fā)現(xiàn)源自人參根的人參皂甙能有效控制高脂飲食條件下，進(jìn)食小鼠的體重，小鼠機(jī)體血漿中的三酰甘油量低于預(yù)期值，其對(duì)于胰脂肪酶的 IC50值為 500 μg/mL[13]。

苦瓜（Momordica charantia）是一種藥食同源的葫蘆科植物食材，性苦味寒，是中國(guó)家庭常用蔬菜之一。其含有豐富的皂甙類物質(zhì)，主要由皂甙元和糖、糖醛酸組成，苦瓜皂甙（Momordica saponins）不僅具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、降低膽固醇、抗艾滋病毒等生理功能，也具有較強(qiáng)的抑制脂肪酶酶活性的作用[14-15]，其可能會(huì)成為減肥的輔助食物補(bǔ)充劑。本研究目的是優(yōu)化乙醇溶劑法提取苦瓜皂甙的工藝條件，并對(duì)苦瓜皂甙對(duì)胰脂肪酶的抑制性做出相應(yīng)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜粉：朝陽大地農(nóng)產(chǎn)品加工有限公司；豬源胰脂肪酶、人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；橄欖油：中國(guó)糧油食品進(jìn)出口有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本EYELA公司；NTS-4000C型恒溫振蕩水槽：東京理化器械株式會(huì)社；FW80微型高速萬能粉碎機(jī)：天津市華鑫儀器廠；ZHWY-2102C新型恒溫震蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；AL204型電子天平、UV5紫外可見分光光度計(jì)：梅特勒－托利多儀器上海有限公司；FDU-810型冷凍干燥機(jī)：日本東京理化。

1.3 方法

1.3.1 苦瓜皂甙提取的基本工藝路線

苦瓜粉→正己烷脫脂→乙醇浸提（合并浸提液）→離心→過濾→得皂甙粗液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液→測(cè)定濃度→真空冷凍干燥→皂甙粉→測(cè)定胰脂肪酶活力抑制率[16-17]

1.3.2 苦瓜粉脫脂處理

苦瓜粉脫脂采用正己烷脫脂法[18]，具體步驟如下：干燥的苦瓜粉碎過24目篩，收集粉末；取20 g篩分的粉末，按苦瓜粉 ∶正己烷=1.0∶2.5（g/mL）混勻，并于4℃下磁力攪拌30 min進(jìn)行脫脂；然后4℃下離心（4 000 g）10 min，棄上清，并重復(fù)上述3次操作，最后沉淀物（即脫脂后的苦瓜粉）干燥備用。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化苦瓜皂甙提取條件

為確定苦瓜皂甙的提取最佳提取條件，以提取物產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用三步法進(jìn)行優(yōu)化。第一步采用五因素二水平部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，挑選出顯著影響因素；第二歩通過最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)值最大時(shí)的中心試驗(yàn)點(diǎn)；第三步利用響應(yīng)曲面法中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)的苦瓜皂甙提取條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Response surface test design factors and level table

1.3.4 苦瓜皂甙提取產(chǎn)率的測(cè)定與計(jì)算

苦瓜皂甙含量的測(cè)定利用分光光度法[19]進(jìn)行：以人參皂苷Rg1作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在550 nm處測(cè)定吸光度，最后依據(jù)回歸方程，計(jì)算樣品中苦瓜皂甙的含量。苦瓜皂甙的提取產(chǎn)率按下式計(jì)算：

式中：m1為樣品溶液中苦瓜皂甙的質(zhì)量，mg；m2為脫脂苦瓜干粉的質(zhì)量，mg。

1.3.5 胰脂肪酶抑制率的測(cè)定

在50 mL的三角燒瓶中加入15 mL反應(yīng)介質(zhì)（150 mmol/L NaCl2、2 mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl2，0.08 mg/L豬膽鹽）和0.5 g底物乳液（4%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以3∶1混合，高速攪拌均勻，得乳白色）[20]，機(jī)械攪拌5 min后加入一定量的豬胰脂肪酶混勻，反應(yīng)3 min后，加入15 mL 95%的乙醇滅活胰脂肪酶。在反應(yīng)完的體系中加入酚紅－麝香草酚藍(lán)指示劑1滴～2滴，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，使反應(yīng)液的pH值恒定在7.5，記錄消耗NaOH滴定液的體積A（mL）?？瞻自囼?yàn)在加入15 mL乙醇之后再加入脂肪酶，記錄消耗NaOH滴定液的體積B（mL）。按下式計(jì)算脂肪酶活力：

式中：A為平行試驗(yàn)組消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積，mL；B為空白試驗(yàn)消耗氫氧化鈉滴定液的體積，mL；M為氫氧化鈉滴定液的摩爾濃度，mol/L；W為脂肪酶的取樣量，g；T為反應(yīng)時(shí)間，min；

胰脂肪酶活力單位定義：在37℃，pH值為7.5的條件下，脂肪酶每分鐘水解三丁酸甘油脂生成1 μmoL脂肪酸所需的酶量，為1活力單位。

對(duì)于胰脂肪酶的抑制率的計(jì)算按照公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 苦瓜皂甙對(duì)胰脂肪酶抑制率的測(cè)定

將苦瓜皂甙浸提物配制成濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL 不同溶液，參考 1.3.5胰脂肪酶抑制率的測(cè)定方法，測(cè)定各種濃度苦瓜粉浸提物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分因子試驗(yàn)結(jié)果及回歸分析

部分因子試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 部分因子試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of some factors

部分因子試驗(yàn)結(jié)果回歸分析見表3。

表3部分因子試驗(yàn)結(jié)果的回歸表明：溫度、時(shí)間和料液比3個(gè)預(yù)測(cè)變量P值均小于0.05，因此它們是苦瓜皂甙提取過程中顯著性影響因子。

2.2 中心試驗(yàn)點(diǎn)的確定結(jié)果

在確定了苦瓜皂甙浸提過程中顯著性影響因子后，針對(duì)浸提溫度、時(shí)間和料液比進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，顯著因素的方向、步長(zhǎng)和試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表3 部分因子試驗(yàn)結(jié)果回歸分析Table 3 Regression analysis of partial factor experimental results

表4 最陡爬坡試驗(yàn)及結(jié)果Table 4 Experiment and results of the steepest climb

從表4中可以看出在溫度為40℃、時(shí)間為75 min、料液比1∶13（g/mL）時(shí)苦瓜皂甙的產(chǎn)率達(dá)到最大值，確定該組合為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.3 最佳浸提條件的確定結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選取浸提次數(shù)在較低水平，即1次，乙醇濃度在較高水平，即50%，進(jìn)行三因素三水平中心組合試驗(yàn)。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及響應(yīng)結(jié)果如表5所示。

表5 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of central composite experiment

續(xù)表5 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果Continue table 5 Results of central composite experiment

用Design Expert 8.0.6響應(yīng)面分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得到二次回歸方程式：

Y=-17.17030+0.099881X4+0.087809X3+1.97715X5-0.000 1X3X4-0.004 595X4X5+0.003 959X3X5-0.000 395 9 X4X4-0.000 945 9X3X3-0.080 13X5X5

決定系數(shù)R2=0.926 4，說明回歸方程擬合較好。

。按照實(shí)際需求，D大多處于30～60 s范圍內(nèi)；而發(fā)車間隔H在高峰段約為120～300 s，在低峰段約為180～600 s。由此可確定基因的長(zhǎng)度，并相應(yīng)隨機(jī)選擇50個(gè)個(gè)體組成種群。

2.3.2 回歸分析模型及方差分析

回歸分析模型及方差分析結(jié)果見表6。

表6 回歸分析模型及方差分析結(jié)果Table 6 Box-behken experiment and results

從表6中可以看到，回歸模型的顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外失擬項(xiàng)P值為0.113 8＞0.05不顯著，進(jìn)一步說明模型擬合程度較好，用上述回歸方程可很好地描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，因此可用該回歸方程對(duì)苦瓜皂甙的提取產(chǎn)率進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。同時(shí)其自變量一次項(xiàng)X3，X5，二次項(xiàng)X32，X42，X52，交互項(xiàng) X3X5，X4X5均顯著（P＜0.05），說明它們對(duì)苦瓜皂甙的提取產(chǎn)率有顯著影響。

2.3.3 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件確定

響應(yīng)面分析方法中的等高線圖可以直觀反映兩因素交互作用的顯著程度，橢圓形表明兩因子相互作用顯著，而圓形恰好相反，表明不顯著[21-22]。各因素交互作用對(duì)皂苷提取率的曲面圖和等高線圖見圖1。

圖1 各因素交互作用對(duì)皂苷提取率的曲面圖和等高線圖Fig.1 Curve diagram and contour diagram of extraction rate of saponin by interaction of various factors

由圖1 a的曲面圖可以看出當(dāng)溫度不變時(shí)，苦瓜皂甙的提取產(chǎn)率隨著時(shí)間的增大呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而當(dāng)時(shí)間不變時(shí)，苦瓜皂甙的提取產(chǎn)率對(duì)溫度差異不敏感，沒有明顯變化。由等高線可知，提取時(shí)間比溫度對(duì)皂甙提取產(chǎn)率影響大，與方差分析一致。當(dāng)溫度在33℃～48℃，時(shí)間在72 min～80 min時(shí)，有利于苦瓜皂甙的提取。

由圖1 b可以看出當(dāng)溫度和料液比分別不變時(shí)，伴隨著溫度和料液比的增大，苦瓜皂甙的提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。由等高線可知，與溫度相比，苦瓜皂甙的提取率受料液比的影響較大，與方差分析一致。當(dāng)溫度在33℃～47℃，料液比在1∶12.8（g/mL）～1∶13.75（g/mL）時(shí)，有利于苦瓜皂甙的提取。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得到提取苦瓜皂甙的最佳工藝條件為：乙醇濃度為50%，料液比為 1∶13.5（g/mL），浸提溫度為38.34℃，浸提時(shí)間為77.11 min，浸提次數(shù)為1次時(shí)，提取產(chǎn)率為1.428 4%。

2.4 最佳浸提條件試驗(yàn)結(jié)果

利用上述響應(yīng)面法試驗(yàn)得到的苦瓜皂甙的提取條件，進(jìn)行3次提取試驗(yàn)（平行試驗(yàn)），結(jié)果見表7。

表7 驗(yàn)證與比較試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Verification and comparison of experimental results

由表7結(jié)果可知，最終皂甙產(chǎn)率達(dá)1.419 1%，與數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的最大產(chǎn)率符合，說明50%乙醇、料液比 1∶13.5（g/mL），溫度 38℃，浸提 77min，浸提 1次是苦瓜皂甙提取的最優(yōu)條件。

2.5 不同濃度的苦瓜皂甙對(duì)胰脂肪酶抑制率的分析結(jié)果

苦瓜皂甙濃度對(duì)其脂肪酶抑制率的影響見圖2。

圖2 苦瓜皂甙濃度對(duì)其脂肪酶抑制率的影響Fig.2 Effect of concentration of Momordica saponins on inhibition rate

從圖2可以看出：當(dāng)苦瓜皂甙的濃度在0～8mg范圍內(nèi)，抑制率隨著濃度的增大而增大，即提高對(duì)于胰脂肪酶活性的抑制程度；當(dāng)濃度在8 mg～10 mg范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，抑制率的提高逐漸趨于平緩，由圖2可以計(jì)算出IC50為0.384 7 mg/mL。

3 結(jié)論

苦瓜皂甙最佳浸提條件為：浸提時(shí)間77 min、乙醇濃度 50%、浸提溫度 38℃，料液比 1∶13.5（g/mL），浸提次數(shù)1次；此條件下苦瓜皂甙產(chǎn)率達(dá)到1.419 1%；所得苦瓜皂甙對(duì)胰脂肪酶的IC50值為0.384 7 mg/mL。