4個(gè)黃芪異黃酮類化合物對(duì)PC 12細(xì)胞分化的影響

吳丘玲，成彥瓊，劉愛軍，張衛(wèi)東,3 （.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 00433；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海 00433）

腦中風(fēng)是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一類疾病[1]。大多數(shù)患者在治療后會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能缺損，比如偏癱、嘴歪眼斜、智力障礙、語言認(rèn)知功能喪失等[2]。因而開發(fā)神經(jīng)恢復(fù)劑，修復(fù)損傷神經(jīng)功能尤為重要。修復(fù)受損神經(jīng)功能的途徑之一是促進(jìn)被破壞或受損害的神經(jīng)重塑[3]。神經(jīng)重塑通過誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，促進(jìn)突起向外生長(zhǎng)，與其他神經(jīng)元建立連接，重構(gòu)皮層，從而修復(fù)損傷的神經(jīng)功能[4]。

黃芪異黃酮類化合物主要包括毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷，結(jié)構(gòu)如圖1所示[5]。毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷對(duì)急性腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)缺血后腦損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)作用未見報(bào)道[6-8]。

PC 12細(xì)胞是來源于成年大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞系，培養(yǎng)PC 12細(xì)胞可動(dòng)態(tài)觀察其神經(jīng)分化的過程[9]，因此可將PC 12細(xì)胞作為篩選促神經(jīng)分化、恢復(fù)損傷神經(jīng)功能藥物的理想模型。本項(xiàng)研究工作使用PC 12細(xì)胞，觀察毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷是否具有誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)分化的能力。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)具有明確的促進(jìn)神經(jīng)元分化作用[10]，在本研究中用作陽性對(duì)照。

圖 1 毛蕊異黃酮（A）、刺芒柄花素（B）、毛蕊異黃酮苷（C）、芒柄花苷（D）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；刺芒柄花素（純度≥98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司）；多聚-L-賴氨酸（Biosharp公司）；胎牛血清（ScienCell公司）；特級(jí)馬血清（索萊寶公司）；丙酮酸鈉和 RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；磷酸鹽緩沖液（博光公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和 Triton X-100（碧云天）；4% 多聚甲醛（武漢賽維爾生物科技有限公司）；重組大鼠β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF，R & D 公司）；β 微管蛋白（β III-tubulin，Abcam 公 司 ）； Alexa Fluor TM 568兔 抗 小 鼠IgG(H+L)（Invitrogen 公司）。

6孔板培養(yǎng)皿和10 ml培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning公司）；倒置熒光顯微鏡 (DMI3000 B，德國(guó) Leica公司）；精密電子天平（美國(guó)Ohaus公司）。

1.2 PC 12 細(xì)胞培養(yǎng)

PC 12細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，經(jīng)復(fù)蘇后，加入含10%馬血清、5%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱（37 ℃，95% 空氣，5%CO2）中傳代培養(yǎng)，每 2 d 傳代 1 次。

1.3 NGF 及黃芪異黃酮類化合物對(duì) PC 12 細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)的影響

將 PC 12 細(xì)胞以 5×104/ml的密度涂覆在多聚-L-賴氨酸包被過的6孔板中，放置于培養(yǎng)箱中孵育過夜。24 h后，換分化培養(yǎng)基（含1%馬血清、1%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素），加不同濃度 NGF（0.3～100.0 ng/ml）、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷（0.01～10.00 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)。每天更換一次上述化合物和分化培養(yǎng)基，連續(xù)3 d。培養(yǎng)5 d后在顯微鏡下觀察各組PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)的情況。將長(zhǎng)度超過一個(gè)細(xì)胞體的神經(jīng)突記為陽性細(xì)胞[11]。在每孔中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別計(jì)算神經(jīng)突細(xì)胞的百分比，然后計(jì)算平均值。

1.4 NGF 及黃芪異黃酮類化合物對(duì) PC 12 細(xì)胞 β III-tubulin蛋白表達(dá)的影響

PC 12 細(xì)胞處理方式同“1.3”項(xiàng)，培養(yǎng) 5 d 后用免疫熒光染色方法檢測(cè)β III-tubulin蛋白的表達(dá)。各組 PC 12細(xì)胞經(jīng) 4%多聚甲醛固定 20 min、Triton X-100 透化 15 min、5% 脫脂牛奶封閉 1 h、一抗 β III-tubulin（1:100）4 ℃ 孵育過夜、二抗（1:500）室溫孵育 1 h、DAPI室溫染色 20 min 后在熒光顯微鏡下觀察β III-tubulin和DAPI的表達(dá)情況。在每孔中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)β III-tubulin表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)目，然后計(jì)算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad軟件分析，數(shù)據(jù)采用（均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，組間數(shù)據(jù)采用方差分析，以P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度 NGF 對(duì) PC 12 細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)的影響

如圖 2 所示，與溶媒組相比，0.3 ng/ml NGF 對(duì)PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)無促進(jìn)作用。與溶媒組相比，NGF（1～100 ng/ml）顯著促進(jìn) PC 12 細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)，且具有濃度依賴性。

圖 2 不同濃度的NGF對(duì)PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)染色圖（A）及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖（B）

2.2 不同濃度及黃芪異黃酮類化合物對(duì) PC 12 細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)的影響

如圖 3 所示，與溶媒組相比，10 ng/ml NGF 能顯著促進(jìn)PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)。與溶媒組相比，毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷（0.01～10 μmol/L）對(duì) PC 12 細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)無促進(jìn)作用。

2.3 不同濃度 NGF 對(duì) PC 12 細(xì)胞中 β III-tubulin蛋白表達(dá)的影響

如圖 4 所示，與溶媒組相比，0.3 ng/ml NGF 對(duì)PC 12細(xì)胞中β III-tubulin蛋白表達(dá)無影響。與溶媒組相比，NGF（1～100 ng/ml）顯著促進(jìn) PC 12 細(xì)胞中β III-tubulin蛋白的表達(dá)，且具有濃度依賴性。

2.4 不同濃度黃芪異黃酮類化合物對(duì) PC 12 細(xì)胞β III-tubulin蛋白表達(dá)的影響

如圖 5 所示，與溶媒組相比，10 ng/ml NGF 能顯著增加PC 12細(xì)胞中β III-tubulin蛋白的表達(dá)。與溶媒組相比，毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷（0.01～10.00 μmol/L）對(duì) PC 12 細(xì)胞中β III-tubulin蛋白表達(dá)無影響。

圖 3 不同濃度黃芪異黃酮類化合物對(duì)PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)染色圖（A）及數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖（B）

圖 4 不同濃度NGF對(duì)PC 12細(xì)胞中β III-tubulin蛋白表達(dá)（A）及陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖（B）

圖 5 不同濃度黃芪異黃酮類化合物對(duì)PC 12細(xì)胞中β III-tubulin蛋白表達(dá)（A）及陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)（B）

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷對(duì)急性腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，通過抗自噬、抗凋亡、抗炎等發(fā)揮作用[7-8,12-15]。毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷對(duì)神經(jīng)元分化、缺血后腦損傷神經(jīng)功能的作用很少提及。本研究初步探討了毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷對(duì)PC 12細(xì)胞神經(jīng)分化的影響，發(fā)現(xiàn)其未能誘導(dǎo)PC 12細(xì)胞分化。

在特定因素刺激下，神經(jīng)元的突起向外生長(zhǎng)，促進(jìn)受損神經(jīng)元的分化，重新建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，恢復(fù)受損的神經(jīng)功能[16]。β III-tubulin在微管元件中只表示神經(jīng)元，是神經(jīng)細(xì)胞分化的表型標(biāo)志物，增加其表達(dá)可改變神經(jīng)元骨架，促進(jìn)突起向外生長(zhǎng)[17-18]。在本研究中，我們主要以PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)和β III-tubulin蛋白表達(dá)作為主要的分化指標(biāo)。

在本研究中，用NGF（陽性對(duì)照）、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷分別刺激PC 12細(xì)胞，觀察藥物對(duì)細(xì)胞突向外生長(zhǎng)的影響。利用免疫熒光染色來觀察藥物對(duì)PC 12細(xì)胞β III-tubulin蛋白表達(dá)的影響。通過以上兩方面的初步研究，我們發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷均沒有促進(jìn)PC 12細(xì)胞突起向外生長(zhǎng)和β III-tubulin蛋白表達(dá)。

綜上得出結(jié)論：毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷對(duì)PC 12細(xì)胞分化無促進(jìn)作用。