腎衰寧顆粒指紋圖譜研究及3種有效成分含量測定

宋新華，陳旭嬌，鄧馮沂，高守紅，彭 輝 （.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 6000；.浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 杭州 000；.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 0000；.宜春市人民醫(yī)院，江西 宜春6000）

腎衰寧顆粒由太子參、黃連、制半夏、陳皮、茯苓、大黃、丹參、牛膝、紅花、甘草等十味中藥制成；具有補(bǔ)氣健脾，活血化痰，祛濁的功效[1]。有文獻(xiàn)表明，腎衰寧在治療慢性腎臟疾病中療效較為顯著[2]；在尿毒癥腹膜透析患者的治療過程中能夠降低血清硫酸吲哚酯濃度[3]；對于慢性腎臟病的Ⅳ期患者，在西醫(yī)基礎(chǔ)治療的同時(shí)服用腎衰寧顆粒，可以明顯改善腎功能，同時(shí)提升患者的治愈率，具有較高的臨床使用價(jià)值[4]。由于中藥成分復(fù)雜[5]，使得如何控制中藥的質(zhì)量成為十分重要的問題。指紋圖譜是在了解中藥物質(zhì)整體作用的基礎(chǔ)上，通過光譜和色譜技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，以鑒別中藥的真?zhèn)危u價(jià)質(zhì)量的一致性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性，其具有信息量大、特征性強(qiáng)、完整性和模糊性等特點(diǎn)[6]。指紋圖譜中的質(zhì)量控制技術(shù)既能保證中藥的功效，又在實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化過程中起關(guān)鍵性作用[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)以10個(gè)批次的腎衰寧顆粒為研究對象，擬建立腎衰寧顆粒的指紋圖譜，對腎衰寧顆粒進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

腎衰寧顆粒是由十味中藥組成的復(fù)方制劑，其化學(xué)成分十分復(fù)雜，且許多復(fù)方治療疾病的藥物基礎(chǔ)并不明顯，因此檢測成分必須是發(fā)揮藥效的有效成分[8]，本實(shí)驗(yàn)針對大黃中的大黃酚（chrysophanol）[9-10]、丹參中的丹酚酸 B（salvianolic acid B）[11]、陳皮中的橙皮苷（hesperidin）[9,12]3 種指標(biāo)性成分，進(jìn)行HPLC法含量測定。在多成分的質(zhì)量控制檢測成本高而對照品緊缺的情況下，能較大程度地節(jié)約檢驗(yàn)成本，又可較全面地控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥的有效性和安全性，同時(shí)為腎衰寧顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國 Agilent公司），包含G1311C四元泵，G1329B自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G4212B-DAD二極管陣列檢測器，Chemstation色譜工作站；光電分析天平（德國Sartorius公司，CPA 225D 型），最大載荷 220 g，分度值0.01 mg；冷凍真空濃縮儀（丹麥Labogene公司，ScanVac ScanSpeed 40 型）；超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，SK7200H型）；渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，Vortex QL-901型）。

1.2 試劑

腎衰寧顆粒（德元堂制藥集團(tuán)，批號：51103111、51103009 346、51103010 471、51103011 593、 51103105、 51103018 486、 41103033 563、51103110、 61103102、 61103101）。蛻皮激素（ecdysterone，批號：P11N6F5706）、甘草苷（liquiritin，批號：2O1027BA14）、甘草酸（glycyrrhizic acid，批號：230A6B1）、大黃酚（chrysophanol，批號：T31O6F5345）、丹酚酸B（salvianolic acid B，批號：Y14M7H14804）、橙皮苷（hesperidin，批號：K02M3C1）對照品，均由上海源葉有限公司提供。大黃素（modin，批號：110756-200110）、鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，批號：09030522）對照品，由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸，均為德國Merck公司生產(chǎn)，色譜純。二氯甲烷，色譜純。水為純凈水，娃哈哈公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFire? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相 A：乙腈；流動相 B：0.1% 甲酸溶液，梯度洗脫。流速：1 ml/min。柱溫：25 ℃。進(jìn)樣量：10 μl。檢測波長：254 nm。梯度洗脫條件見表 1。

表 1 梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備

精密依次稱取丹酚酸B、橙皮苷、大黃素標(biāo)準(zhǔn)品 10.25、10.35、10.05 mg，分別置于 10 ml容量瓶中，以純甲醇定容至刻度，搖勻，得儲備液并將其分裝后儲存于-20 ℃的冰箱中。精密稱取10.10 mg大黃酚，置于10 ml容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，超聲處理3 min，然后用純甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到對照品的儲備液，置于-20 ℃冰箱保存。

2.3 供試品溶液的制備

取腎衰寧顆粒適量，研磨成細(xì)粉，混合均勻，精密稱取0.10 g，加適量70%甲醇溶液使其溶解，超聲 45 min，再用 70% 甲醇溶液定容至 2 ml，冷卻，過0.45 μm微孔濾膜后，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

2.4 腎衰寧顆粒 HPLC 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取腎衰寧顆粒（批號：41103033 563），按照“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，通過大黃素（7號色譜峰）作為參照峰，確定相對保留時(shí)間和相對峰面積。相對保留時(shí)間的RSD在1.0%以內(nèi)，相對峰面積的RSD在2.0%以內(nèi)，表明進(jìn)樣儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取腎衰寧顆粒（批號：41103033 563），按照“2.3”項(xiàng)平行制備5份供試品溶液，測定在“2.1”項(xiàng)色譜條件下的相對保留時(shí)間和相對峰面積。相對保留時(shí)間RSD在1.0%以內(nèi)，相對保留面積RSD在2.0%以內(nèi)。表明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取腎衰寧顆粒（批號：41103033 563），并根據(jù)“2.3”項(xiàng)下平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別記錄 0、4、8、24、36 h的相對保留時(shí)間和相對峰面積。相對保留時(shí)間RSD在1.0%以內(nèi)，相對保留面積RSD在2.0%以內(nèi)。表明供試樣品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.5 指紋圖譜結(jié)果與分析

分別稱取10個(gè)批次的腎衰寧粉末，按照“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，每個(gè)批次平行制備3份供試品溶液，記錄圖譜，見圖1。利用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2008A版”的軟件，將10批次腎衰寧顆粒的圖譜導(dǎo)入，將批號為61103102的樣品溶液用作針對相似性計(jì)算校正的參考圖。結(jié)果顯示，1～9批制劑間指紋圖譜與對照圖譜之間相似度均不小于0.90，見表2，表明相似度良好。對保留時(shí)間0～60 min內(nèi)的色譜峰進(jìn)行分析，均有22個(gè)穩(wěn)定的特征峰，確定其為腎衰寧的共有指紋峰，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品比對，其中，6號峰為橙皮苷，14號峰為丹酚酸B，21號峰為大黃酚。

圖 1 10 批腎衰寧顆粒的色譜圖

表 2 10 批腎衰寧顆粒 HPLC 指紋圖譜相似度

2.6 腎衰寧顆粒中 3種有效成分的含量測定

2.6.1 線性結(jié)果考察

按照“2.2”項(xiàng)下制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到混合對照品色譜圖見圖2。將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用純甲醇稀釋，丹酚酸 B濃度梯度為：10、20、40、80和 100 μg/ml；橙皮苷濃度梯度為：40、80、160、320 和 400 μg/ml；大黃酚濃度梯度為：8、16、40、100和 350 μg/ml。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別記錄3種成分的峰面積，以峰面積（Y）對濃度（Χ）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

2.6.2 精密度試驗(yàn)

取同一對照品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，并記錄峰面積。橙皮苷、丹酚酸B、大黃酚峰面積的RSD分別為0.17%、0.20%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 檢測限和定量限

精密吸取橙皮苷、丹酚酸B、大黃酚對照品溶液適量，使用甲醇逐步稀釋，至色譜圖中上述3種成分的峰高分別為噪音的3倍和10倍，測得橙皮苷的檢測限和定量限分別為0.18和1 μg/ml；丹酚酸B的檢測限和定量限分別為0.3和1.2 μg/ml；大黃酚的檢測限和定量限分別為1和5 μg/ml。

圖 2 混合對照品溶液（A）和供試品溶液（B）色譜圖

表 3 各成分線性關(guān)系

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號：41103033 563），并根據(jù)“2.1”項(xiàng)色譜條件在 0、2、4、8、24、36 h測定。橙皮苷、丹酚酸B、大黃酚的峰面積的RSD分別為2.01%、2.22%、2.05%，結(jié)果表明：供試品在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號：41103033 563），平行制備6份，并根據(jù)“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，橙皮苷、丹酚酸B、大黃酚的峰面積的RSD分別為0.67%、2.00%、2.02%，表明系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取腎衰寧溶液1 ml，分別加入100%含量橙皮苷對照品（理論值為 192.02 μg），100% 含量丹酚酸 B對照品（理論值為 62.66 μg），100%含量大黃酚對照品（理論值 35.22 μg），按照“2.2”項(xiàng)平行制備6份，并根據(jù)“2.1”的色譜條件進(jìn)行測量，按照下述公式計(jì)算加樣回收率，平均加樣回收分別為119.20%、84.69%、84.58%。結(jié)果見表4。

回收率=（實(shí)測量-樣品含量）/加入量×100%。

2.6.7 樣品含量測定

取10批腎衰寧顆粒，按“2.2”項(xiàng)制備試液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

在190～400 nm處全波長掃描，鹽酸小檗堿、大黃素、大黃酚、丹酚酸B、蛻皮激素、甘草酸、甘草苷、橙皮苷分別在 345、254、254、286、250、237、237、283 nm 處有最大吸收，通過對比分析，在波長254 nm處，上述8種成分具有良好的響應(yīng)，樣品中相鄰色譜峰的基線分離可以滿足含量檢測的要求。因此，選擇波長254 nm作為檢測波長。

3.2 樣品前處理的方法優(yōu)化

將腎衰寧粉末直接用水溶解后進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)樣品出峰很少，所測成分在色譜條件下沒有吸收。后用 50%、70%、80%的甲醇溶解樣品，發(fā)現(xiàn)用70%甲醇溶解出峰數(shù)最多，且所測成分在此條件下均有吸收，故選擇70%甲醇進(jìn)行樣品的前處理。

3.3 流動相的選擇

有文獻(xiàn)報(bào)道，腎衰寧含量測定使用甲醇-0.1%磷酸[13]、乙腈-水-1%甲酸[14]、乙腈-05%磷酸[15]進(jìn)行90 min的大梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)色譜峰分不開，且特征峰較少。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定乙腈-0.1%甲酸水溶液用作梯度洗脫的流動相，分離出樣品中測得的特征峰，特征峰很多，峰形良好。

表 4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表 5 10 批腎衰寧樣品中 3 種成分的測定結(jié)果