肉桂預(yù)煎液中有效成分肉桂酸的穩(wěn)定性研究

李群英，李盛建，須添翼，解李春子，趙 亮，須秋萍 （.上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院，上海 0908；.上海市寶山區(qū)大場(chǎng)鎮(zhèn)祁連社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 00444）

中藥代煎使用自動(dòng)煎藥機(jī)，機(jī)械化生產(chǎn)效率高，加水量、煎藥時(shí)間容易控制，能做到煎藥規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)字化管理[1-2]。中藥處方中經(jīng)常有“先煎”、“后下”的藥材，需要特殊煎法時(shí)特別處理，一般先按要求煎好，分裝后保存，用時(shí)加入到復(fù)方中混合。提取液的放置環(huán)境溫度及時(shí)間長(zhǎng)短都會(huì)影響到有效成分的穩(wěn)定性從而降低復(fù)方湯劑的藥效。目前中藥“后下”品種預(yù)煎液尚無(wú)完整的質(zhì)量控制過(guò)程，缺少有效的質(zhì)量監(jiān)管措施，難以保證中藥代煎液臨床療效的一致性。

肉桂為樟科（Lauraceae）樟屬植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥樹(shù)皮，因含有豐富的芳香族、萜類(lèi)、脂肪族等揮發(fā)油化合物，長(zhǎng)時(shí)間煎煮會(huì)導(dǎo)致藥性損失，故中藥傳統(tǒng)煎煮方法將其作為“后下”品種。肉桂酸作為肉桂主要的藥效成分，具有抗菌、抗癌、發(fā)汗等作用[3-5]。本研究以“后下”品種肉桂預(yù)煎液為例，以有效成分含量變化作為觀察指標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定有效成分肉桂酸的含量，研究不同儲(chǔ)存溫度及時(shí)間對(duì)肉桂袋裝預(yù)煮液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響，并為今后制訂“后下”中藥預(yù)煎液儲(chǔ)存規(guī)范提供一定的科學(xué)依據(jù)。肉桂酸有多種含量測(cè)定方法，包括HPLC法[6]、近紅外定量校正法[7]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等，其中，HPLC法具有較多優(yōu)點(diǎn)，如速度快、分辨率高等[9]。因此，筆者首先考慮使用HPLC法測(cè)定肉桂預(yù)煎液中有效成分肉桂酸的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó)Agilent公司1100系列HPLC儀(在線(xiàn)脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器)；瑞士梅特勒-托利多公司 METYLER AE240型十萬(wàn)分之一電子天平；上海科導(dǎo)超聲儀器公司SB 3200-T超聲發(fā)生器。

1.2 試藥

肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)：6648，上海詩(shī)丹德生物科技有限公司）；甲醇和乙腈均為色譜純（美國(guó)Merck公司），甲酸為色譜純（SIGMA 公司），水為超純水；肉桂預(yù)煎液（批號(hào)：191213，上海同濟(jì)堂藥業(yè)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.1% 甲酸溶液-乙腈（60:40），比例流速 1.0 ml/min，柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 5 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm，分析時(shí)間：16 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取肉桂酸對(duì)照品 10.21 mg，置于 10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.021 mg/ml的肉桂酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，置冰箱4 ℃保存。

2.2.2 供試品溶液

取適量肉桂預(yù)煎液，12 000×g離心 5 min，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取供試品和對(duì)照品溶液，按“2.1 色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，得液相色譜圖，見(jiàn)圖1，肉桂酸的保留時(shí)間為13.8 min，色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000。結(jié)果表明，肉桂酸色譜峰與其他成分色譜峰得到較好的分離。

圖 1 肉桂酸 HPLC 色譜圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

采用逐級(jí)稀釋法，精密量取適量對(duì)照品溶液，置于10 ml容量瓶中，加入甲醇定容，得到肉桂酸的濃度分別為10.21、20.42、51.05、102.10、204.20 μg/ml系列的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣。以濃度為橫坐標(biāo)(Χ)，色譜峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到線(xiàn)性回歸方程：Y=48.32Χ+8.819，r=0.999 9。結(jié)果表明肉桂酸在10.21～204.20 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取低、中、高3 個(gè)濃度（20.42、51.05、102.10 μg/ml）對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次，連續(xù)3 d測(cè)定，記錄色譜峰面積，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果肉桂酸日內(nèi)精密度RSD值分別為0.36%、0.96%、0.81%(n=3)，日間精密度RSD值分別為1.67%、1.20%、1.10%；結(jié)果顯示該方法精密度符合方法學(xué)要求，儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次肉桂預(yù)煎液，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果肉桂酸預(yù)煎液中肉桂酸峰面積的RSD為1.12%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，分別在 0、4、8、12、24、48 h測(cè)定供試品溶液中肉桂酸的含量，考察供試品常溫下放置穩(wěn)定性，肉桂酸RSD為1.13%，結(jié)果表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取 1 ml肉桂預(yù)煎液，置于含 51.05 μg肉桂酸(氮?dú)鈸]干)離心管中，渦旋30 s，平行操作5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表1所示，肉桂酸的平均加樣回收率為98.9%（RSD=1.9%，n=5），結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.9 肉桂酸長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3袋肉桂預(yù)煎液于當(dāng)日（第0天）測(cè)定肉桂酸的含量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作制備溶液，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，以峰面積外標(biāo)法計(jì)算含量。剩余袋裝藥液分組保存在 4 ℃（冷藏組）、25 ℃(常溫組)、40 ℃（高溫組）恒溫條件下，1、3、7、14、21、30 d后重復(fù)上述步驟，檢測(cè)肉桂酸的含量。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間差異比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為 0.05。結(jié)果如表2所示，與儲(chǔ)存第0天相比，常溫儲(chǔ)存21、30 d，高溫溫儲(chǔ)存 14、21、30 d 測(cè)得的肉桂酸含量均顯著降低（P＜0.01），其他組未發(fā)現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

中藥材從固體飲片變?yōu)橐后w煎劑，質(zhì)量處于不穩(wěn)定狀態(tài)，其后期的質(zhì)控和管理顯得尤為重要[10]。本實(shí)驗(yàn)以本院常用“后下”品種肉桂為例，建立有效成分肉桂酸的HPLC含量測(cè)定方法，在所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，該分析方法快速、準(zhǔn)確、方便；應(yīng)用該方法對(duì)其不同放置條件和時(shí)間的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)考察，為制訂本院“后下”品種預(yù)煎液內(nèi)部質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了水、甲醇、乙腈、甲酸、銨鹽溶液等不同的流動(dòng)相體系，最終選擇0.1%甲酸-乙腈（60:40）作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，樣品中肉桂酸的待測(cè)成分峰形較好，與其他成分可達(dá)到基線(xiàn)分離。通過(guò)DAD進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析肉桂酸的紫外光譜，275 nm波長(zhǎng)下肉桂酸有較高吸收峰，出峰處無(wú)干擾成分，因此選用275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

將有效成分含量變化作為觀察指標(biāo)，兼顧普通患者家庭環(huán)境溫度，分析考察放置環(huán)境和時(shí)間對(duì)肉桂預(yù)煎液穩(wěn)定性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷藏（4 ℃）儲(chǔ)存的藥液在 30 d 內(nèi)基本穩(wěn)定；常溫（25 ℃）儲(chǔ)存 21、30 d后，肉桂酸的濃度顯著下降，分別降到最初濃度的 89.9% 和 80.4%；高溫（40 ℃）儲(chǔ)存 14、21、30 d后，肉桂酸的濃度分別降到最初濃度的93.7%、82.3%和70.5%。由此可見(jiàn)，低溫保存肉桂酸較穩(wěn)定，冷藏有利于肉桂預(yù)煎液的穩(wěn)定性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法為肉桂預(yù)煎液的質(zhì)量控制提供了一種可靠的方法，為后續(xù)制訂含量的質(zhì)量控制范圍奠定了基礎(chǔ)，并為今后制訂“后下”中藥預(yù)煎液儲(chǔ)存規(guī)范提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

表 1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表 2 不同儲(chǔ)存條件下肉桂預(yù)煎液中肉桂酸含量的變化(±s，n=3，μg/ml)

表 2 不同儲(chǔ)存條件下肉桂預(yù)煎液中肉桂酸含量的變化(±s，n=3，μg/ml)

** P＜0.01，與第0天比較。

組別14 21 30冷藏組（4 ℃） 47.27±0.66 47.09±0.73 47.64±1.08 46.51±0.65 46.13±0.73 46.33±0.68 46.28±1.14常溫組（25 ℃） 47.27±0.66 47.66±0.27 47.54±1.14 47.62±0.63 47.15±0.69 42.49±0.54** 38.02±0.60**高溫組（40 ℃） 47.27±0.66 47.30±0.22 47.18±0.61 47.07±0.69 44.38±0.66** 38.90±0.41** 33.31±0.56**儲(chǔ)存時(shí)間（t/d）0 1 3 7