青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌作用及機(jī)制研究

陳向明，何 萍，李 婷，張海清，胡 陽(yáng)

（上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院皮膚科，上海 201802）

痤瘡丙酸桿菌是一種厭氧革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，被認(rèn)為是痤瘡的主要致病菌[1]，可導(dǎo)致炎癥性痤瘡和皮膚細(xì)胞損傷[2]。由于抗菌藥物的過(guò)度使用，痤瘡丙酸桿菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有高安全性和良好的藥物耐受性。有研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯片與鹽酸多西環(huán)素治療酒渣鼻效果相當(dāng)[3]，而患者對(duì)痤瘡丙酸桿菌敏感與酒渣鼻的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[4]。本研究擬分析青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌體外存活、生長(zhǎng)的影響，評(píng)估青蒿琥酯與鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合使用的抑菌效果，并通過(guò)掃描電鏡進(jìn)一步觀察青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌微觀形態(tài)的影響，以探索青蒿琥酯用于治療痤瘡的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 11827）由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供，臨床菌株分離自上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院痤瘡患者皮損組織。

1.2 主要儀器與試劑

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（德國(guó)布魯克-道爾頓公司），S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司），比濁儀（法國(guó)生物梅里埃公司）。青蒿琥酯（日本化成工業(yè)株式會(huì)社公司），鹽酸多西環(huán)素注射液（海南通用康力制藥有限公司）、厭氧菌培養(yǎng)肉湯（美國(guó)BD公司）、普通和厭氧血瓊脂平板（上海伊華科技有限公司），厭氧袋（法國(guó)生物梅里埃公司），革蘭染色液（美國(guó)BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床株的分離、鑒定與保存 從痤瘡患者皮損組織中取分泌物，接種于厭氧血瓊脂平板，置厭氧袋內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，取單個(gè)疑似菌落分別接種于普通和厭氧血瓊脂平板的同一位置，分別置CO2和厭氧環(huán)境中孵育24～48 h。取厭氧菌進(jìn)行革蘭染色鏡檢，并挑取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定細(xì)菌。鑒定后的痤瘡丙酸桿菌置-80℃保存。

1.3.2 藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定青蒿琥酯和鹽酸多西環(huán)素對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC。將100 μL肉湯加入96孔聚苯乙烯板的每個(gè)待測(cè)孔，第1列每孔加藥物100 μL，然后連續(xù)倍比稀釋，共稀釋11個(gè)濃度，青蒿琥酯、鹽酸多西環(huán)素初始濃度分別為48 mg/mL、2.6 μg/mL，每藥1板。加樣細(xì)菌的濃度為105CFU/mL，加樣量為100 μL，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)結(jié)果，以不出現(xiàn)渾濁的最低濃度為藥物的MIC，每株菌設(shè)2個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3 聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn) 采用棋盤式微量稀釋法測(cè)定青蒿琥酯和鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合使用的體外抗菌活性，重復(fù)測(cè)定2次，各藥物的起始濃度為對(duì)應(yīng)的MIC的2倍。試驗(yàn)結(jié)果以分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)作為聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的判斷依據(jù)。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC指數(shù)≤1為相加作用，1＜FIC指數(shù)≤2為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC指數(shù)＞2為拮抗作用。FIC指數(shù)=（A藥聯(lián)合的MIC/A藥單測(cè)MIC）+（B藥聯(lián)合的MIC/B藥單測(cè)MIC）

1.3.4 青蒿琥酯和鹽酸多西環(huán)素對(duì)痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響 分別觀察痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株在青蒿琥酯、鹽酸多西環(huán)素單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥中的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)情況。將含對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液100 μL（濃度為105CFU/mL）接種到100 μL含有相應(yīng)藥物的肉湯中培養(yǎng)，藥物終濃度為相應(yīng)MIC，以不加藥物為對(duì)照。在培養(yǎng)12、24、48、72 h后分別取培養(yǎng)液10 μL，105倍稀釋后，取200 μL稀釋菌液涂布于厭氧血瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)（CFU/mL）。

1.3.5 電鏡觀察 將100 μL痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液（濃度為105CFU/mL）加到2 mL厭氧培養(yǎng)肉湯中厭氧培養(yǎng)24 h，然后加入青蒿琥酯，使藥物濃度為MIC，分別于培養(yǎng)12、24 h后收集培養(yǎng)液，以不加藥物的細(xì)菌培養(yǎng)液為對(duì)照。收集的菌液1000×g離心10 min留取細(xì)菌，細(xì)菌用2%戊二醛固定2 h后送掃描電鏡室試樣制備并掃描觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定結(jié)果

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)臨床分離的13株疑似痤瘡丙酸桿菌菌株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果均為痤瘡丙酸桿菌。部分結(jié)果見圖1。

2.2 形態(tài)學(xué)變化

掃描電鏡觀察可見受試菌株經(jīng)青蒿琥酯作用12 h后，菌體均發(fā)生改變，表面出現(xiàn)凹陷。作用24 h后，可見菌體較對(duì)照菌體短約1.5～2.0 μm，表面凹凸不平，有凹陷、彎折，對(duì)照菌體長(zhǎng)4～5 μm，表面光滑、飽滿。見圖2。

圖1 痤瘡丙酸桿菌臨床分離株質(zhì)譜鑒定圖譜（部分）

圖2 掃描電鏡觀察結(jié)果

2.3 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

青蒿琥酯、鹽酸多西環(huán)素單獨(dú)用藥對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC分別為（1.071±0.688）mg/mL、（0.074±0.041）μg/mL，均高于聯(lián)合用藥的MIC[（0.335±0.207）mg/mL、（0.021±0.014）μg/mL]（P＜0.01）。鹽酸多西環(huán)素和青蒿琥酯聯(lián)合使用可抑制14株痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)，對(duì)3株菌呈協(xié)同作用，對(duì)11株菌呈相加作用。見表1。

2.4 兩藥單獨(dú)及聯(lián)合使用起效時(shí)間比較

青蒿琥酯的抑菌特點(diǎn)是緩慢但持續(xù)，鹽酸多西環(huán)素的抑菌特點(diǎn)是快速起效，兩藥聯(lián)合使用后，降低了各藥濃度，同時(shí)綜合了兩藥的特點(diǎn)，可快速、持續(xù)地抑菌，抑菌效果優(yōu)于兩藥單獨(dú)使用。見圖3。

表1 青蒿琥酯和鹽酸多西環(huán)素單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的MIC

圖3 青蒿琥酯、鹽酸多西環(huán)素單用和聯(lián)合使用的時(shí)間-抑菌曲線

3 討論

青蒿琥酯是全球公認(rèn)的新型抗瘧藥物。目前國(guó)外對(duì)該藥的研究主要集中于其抗瘧活性，因高安全性和良好的藥物耐受性而被關(guān)注[5]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)該藥具有抗寄生蟲、抗癌、抗病毒和抗過(guò)敏的作用。李斌等[6]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯與不同抗菌藥物有協(xié)同抗菌作用。呂品等[7]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）有體外抑菌活性，與頭孢西丁聯(lián)合使用可降低MIC。青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌的作用目前尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC為0.750～3.000 mg/mL，證實(shí)了既往青蒿琥酯治療酒渣鼻的研究推斷出的青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌有抑菌作用的結(jié)論。

青蒿琥酯的抗瘧機(jī)制為分子結(jié)構(gòu)中含有的過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)，在游離鐵或者血紅素結(jié)合鐵的介導(dǎo)下，發(fā)生斷裂，產(chǎn)生自由基，直接作用于瘧原蟲的膜系結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞?；谶@一機(jī)制，蔣為薇[8]發(fā)現(xiàn)高濃度的青蒿琥酯對(duì)MRSA WHO-2菌的細(xì)胞壁有輕微的破壞作用，但在細(xì)菌敏感的濃度下對(duì)菌膜的破壞作用不明顯。本研究掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，細(xì)菌敏感濃度的青蒿琥酯對(duì)痤瘡丙酸桿菌的細(xì)胞壁有輕微的破壞，可能是細(xì)菌種類不同造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，加入青蒿琥酯培養(yǎng)的痤瘡丙酸桿菌較未加青蒿琥酯培養(yǎng)的痤瘡丙酸桿菌菌體的長(zhǎng)度短。SILVA等[9]發(fā)現(xiàn)千層香精油作用于單核細(xì)胞增生李斯特菌時(shí)會(huì)使細(xì)菌變小，表明細(xì)菌在不利生長(zhǎng)的環(huán)境中可改變菌體大小，與本研究結(jié)果一致，提示青蒿琥酯可能具有影響?zhàn)畀彵釛U菌形態(tài)的毒性。

本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯和鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合作用于14株痤瘡丙酸桿菌，其中3株呈協(xié)同作用，11株呈相加作用。有研究結(jié)果證實(shí)由細(xì)胞外基質(zhì)組成的生物膜在痤瘡丙酸桿菌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10]。與浮游細(xì)菌相比，生物膜基質(zhì)中存在的細(xì)菌可增加對(duì)常規(guī)抗菌藥物的耐受性[11]，同時(shí)增加消化酶產(chǎn)量[12]。青蒿琥酯已被證實(shí)能夠降低革蘭陽(yáng)性桿菌銅綠假單胞菌的黏附性，并可破壞成熟生物膜結(jié)構(gòu)[13]。本研究團(tuán)隊(duì)后續(xù)將對(duì)青蒿琥酯是否對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜的形成具有抑制作用，對(duì)成熟生物膜活性是否有影響，從而增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性作進(jìn)一步研究。

既往研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌一氧化氮可以對(duì)抗藥物的殺菌或抑菌作用，青蒿琥酯可結(jié)合細(xì)菌的一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的血紅素基團(tuán)滅活NOS，減少地衣芽孢桿菌產(chǎn)生一氧化氮，可逆轉(zhuǎn)一氧化氮介導(dǎo)的抗菌藥物的滅活作用，而增強(qiáng)利福平的抗菌作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌能夠通過(guò)活性氧依賴的NF-κB級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)iNOS、一氧化氮的表達(dá)[15]，因此青蒿琥酯與鹽酸多西環(huán)素對(duì)痤瘡丙酸桿菌聯(lián)合作用的效果也值得進(jìn)一步研究。