酒精聯(lián)合激素加速兔早期股骨頭壞死的模型建立 及病理學(xué)研究

張震 魏屹東 汪偉基 葉斯波 盧鴻超 徐慧 郭樹章

摘要：目的? 檢測長期較大劑量攝入酒精聯(lián)合應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素能否加速早期股骨頭壞死病程的進展，并探討該方法的有效性。方法? 取6月齡新西蘭大白兔30只，體重2～3 kg，隨機分為三組，空白對照組10只，實驗1組（單純使用糖皮質(zhì)激素）10只，實驗2組（聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素及酒精）10只。實驗1組于雙側(cè)臀肌交替肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液10 ml/kg，每3 d 1次，共10次;實驗2組在實驗1組基礎(chǔ)上給予飲用酒灌胃8 ml/kg，每3 d 1次，共10次;空白對照組于雙側(cè)臀肌交替注射等量生理鹽水，正常飲食、飲水，造模期間觀察實驗動物一般情況，30 d后觀察股骨頭病理學(xué)檢查。結(jié)果? 空白對照組動物未出現(xiàn)脫毛、食量減小及運動改變;實驗1組出現(xiàn)輕微脫毛，無跛行，無食量改變;實驗2組飲食、飲水明顯減少，有脫毛及輕微跛行。三組股骨頭進行冠狀面剖開肉眼觀察未見明顯差別。病理學(xué)觀察示，空白對照組骨小梁粗大，骨陷窩內(nèi)骨細胞形態(tài)正常，脂肪細胞較少;實驗1組骨小梁變薄，空骨陷窩增多，骨細胞核固縮;實驗2組骨小梁變薄，核固縮的骨細胞及空骨陷窩明顯增多。實驗1組，實驗2組，空白對照組空骨陷窩率分別為（8.85±0.99）%、（33.20±1.51）%、（51.30±1.87）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 短期、大劑量給予地塞米松成功構(gòu)建兔早期激素性股骨頭壞死模型，同時在給予激素的過程中加用較大劑量酒精能夠加速股骨頭壞死的病程，可通過病理學(xué)檢查對模型進行有效性評價。

關(guān)鍵詞：激素性股骨頭壞死;酒精性股骨頭壞死;病理學(xué)檢查;動物模型;兔

中圖分類號：R681.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.022

文章編號：1006-1959（2020）08-0067-03

Abstract：Objective? To investigate whether long-term large-dose alcohol intake combined with high-dose glucocorticoids can accelerate the progression of early femoral head necrosis and explore the effectiveness of this method.Methods? 30 New Zealand white rabbits of 6 months old， weighing 2 to 3 kg， were randomly divided into three groups，there were 10 blank control groups， 10 in the experimental group 1 （using glucocorticoids alone）， and 10 in the experimental group 2（using glucocorticoids and alcohol together）. The experimental group 1 was alternately intramuscularly injected with 10 ml/kg of dexamethasone sodium phosphate injection into both gluteal muscles， once every 3 d for a total of 10 times; the experimental group 2 was given 8 ml/kg of drinking wine on the basis of the experimental group 1， Once every 3 d， a total of 10 times; the control group was alternately injected with bilateral saline muscles with the same amount of normal saline， normal diet and drinking water， and observed the general conditions of experimental animals during the modeling period， and observed the femoral head pathology after 30 d.Results? The animals in the control group showed no hair loss， reduced food intake and exercise changes; the experimental group 1 had slight hair loss， no claudication， and no changes in food intake; the experimental group 2 had significantly reduced diet and drinking water， and had hair loss and slight lameness. The three groups of femoral heads showed no obvious difference by coronal plane dissection.Pathological observation showed that the bone trabecula in the control group was thick， the bone cell morphology was normal in the bone lacuna， and there were fewer fat cells; the bone trabecula in the experimental group 1 was thinner， the empty bone lacuna increased， and the bone cell nucleus was contracted，in the experimental group 2， the trabecular bones became thinner， and the bone cells and empty bone lacunae increased significantly. The rates of empty bone lacunae in the experimental group 1 and experimental group 2 were （8.85±0.99）%， （33.20±1.51）%， and （51.30±1.87）%， respectively，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? Short-term and high-dose administration of dexamethasone successfully constructed a rabbit model of early hormonal femoral head necrosis. At the same time， the addition of larger doses of alcohol during the administration of hormones can accelerate the course of femoral head necrosis. Pathological examination can be effective for the model Sexual evaluation.

Key words：Hormonal femoral head necrosis;Alcoholic femoral head necrosis;Pathological examination;Animal model;Rabbit

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是臨床上骨壞死疾病中較常見的一種，目前認為不同原因破壞了股骨頭的血供是發(fā)生股骨頭壞死的根本原因，其特征是因股骨頭血供障礙導(dǎo)致的骨及骨髓細胞壞死、再生，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷、變形，形成嚴重的髖關(guān)節(jié)病變。在造成非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病因中，大劑量使用糖皮質(zhì)激素造成的股骨頭壞死占該病種首位[1]。對于非創(chuàng)傷性股骨頭壞死治療的關(guān)鍵是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)，及時恢復(fù)股骨頭血供，阻止或延緩股骨頭塌陷。建立理想的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型對該病的早期診斷及治療有重要意義。人與動物在激素性股骨頭壞死發(fā)病的病理過程中大致相同，目前常用的造模方法包括單純激素誘導(dǎo)、激素聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)[2]、激素聯(lián)合異體血清誘導(dǎo)[3]。但是激素聯(lián)合內(nèi)毒素或異體血清誘導(dǎo)股骨頭壞死雖然能夠加快病程進展，但是費用較為昂貴，同時存在并發(fā)癥[3，4]。研究表明[5-7]，激素與酒精均可通過影響脂代謝、新血管的生成造成股骨頭內(nèi)微循環(huán)障礙、微血管內(nèi)血栓形成，導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)生。本實驗通過聯(lián)合酒精與激素聯(lián)合誘導(dǎo)兔早期股骨頭壞死模型，以病理學(xué)研究對構(gòu)建的動物模型進行評估，以期研究出一種有效、快速、經(jīng)濟的方法構(gòu)建早期股骨頭壞死動物模型。

1材料和方法

1.1實驗動物? 30只健康年輕的新西蘭大耳白兔（6月齡），體重2～3 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，所有操作符合實驗動物倫理審核要求。標準條件下飼養(yǎng)，每籠1只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法隨機分為三組，每組10只，實驗1組為單純使用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，實驗2組為聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素及酒精誘導(dǎo)，空白對照組不做特殊處理。

1.2實驗藥物及試劑? 地塞米松磷酸鈉注射液（安徽聯(lián)誼藥業(yè)股份有限公司，批號H34021930，規(guī)格：? ? 5 mg/支）、北京紅星二鍋頭（52°）、注射用青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠，批號：A080700411，規(guī)格：8.0×105 U/支）、生理鹽水、奧美拉唑腸溶膠囊（悅康藥業(yè)集團有限公司，批號：H20056577，規(guī)格：20 mg/粒）、40%甲醛溶液、3%戊巴比妥鈉溶液、梯度酒精、蘇木素、伊紅、二甲苯、中性樹脂封固劑（新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供）。

1.3造模及取材

1.3.1造模方法? 實驗1組動物于雙側(cè)臀肌交替肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液10 mg/kg，每3 d注射1次，共10次;實驗2組于雙側(cè)臀肌交替肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液10 mg/kg，每3 d注射1次，共10次，同時以飲用酒（北京紅星二鍋頭）8 ml/kg緩慢灌胃，每3天1次，共10次[1];空白對照組雙側(cè)臀肌交替注射生理鹽水（10 mg/kg）;所有動物雙側(cè)臀肌交替注射青霉素鈉 5萬U/kg，2次/周，共4周，預(yù)防感染。所有動物給予口服奧美拉唑腸溶膠囊20 mg/d預(yù)防大量飲酒導(dǎo)致胃黏膜損傷。4周后處死所有動物，取雙側(cè)股骨頭做病理學(xué)檢查。

1.3.2取材方法? 耳緣靜脈注入空氣法處死，取出雙側(cè)股骨頭，以4%甲醛溶液固定3 d，利用5%硝酸脫鈣，每日更換脫鈣液至大頭針能夠無阻力插入骨組織，終止脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色。

1.4觀察指標

1.4.1 一般情況? 給藥后三組動物食量、脫毛情況、體重及步態(tài)變化。

1.4.2 死亡觀察現(xiàn)象? 記錄死亡時間，并立即解剖分析死因，統(tǒng)計各組死亡數(shù)量。

1.4.3病理組織學(xué)檢查? 光鏡下觀察組織學(xué)切片，骨細胞壞死病理學(xué)改變及計數(shù)空骨陷窩率，在放大倍數(shù)為400倍時，任選5個視野，計數(shù)空骨陷窩率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法? 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以（x±s）表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況? 造模期間，實驗1組動物于第1周出現(xiàn)食量減少，第2周出現(xiàn)活動神志萎靡、脫毛情況，第4周出現(xiàn)食量減少，異常步態(tài);實驗2組動物于第3天出現(xiàn)神志萎靡，食量減少癥狀，1周后出現(xiàn)活動減少，脫毛情況，其中1只動物死亡，取其雙側(cè)股骨頭進行固定，切片，其余動物第3周出現(xiàn)食量明顯減少，體重減輕，步態(tài)異常，第4周出現(xiàn)跛行;空白對照組未出現(xiàn)明顯異常。

2.2死亡觀察現(xiàn)象? 實驗2組中第3天死亡的動物口咽處見較多分泌物，考慮與嘔吐致呼吸道阻塞與大量飲酒刺激有關(guān)，解剖見氣管內(nèi)較多異常分泌物，含食物殘渣，胃內(nèi)有殘余食物，胃壁廣泛充血、水腫，可見大面積潰瘍形成，考慮與大量酒精刺激有關(guān)。

2.3病理組織學(xué)檢查? 空白對照組毛細血管網(wǎng)豐富，股骨頭內(nèi)骨小梁粗大，骨陷窩內(nèi)骨細胞形態(tài)正常，骨髓腔內(nèi)脂肪細胞正常，紅細胞豐富;實驗2組毛細血管網(wǎng)稀疏，股骨頭內(nèi)骨小梁變細，部分斷裂，空骨陷窩明顯增多，可見骨細胞核固縮，骨髓腔內(nèi)脂肪細胞增多，增大;實驗1組介于空白對照組與實驗2組間。實驗1組，實驗2組，空白對照組空骨陷窩率分別為（8.85±0.99）%、（33.20±1.51）%、（51.30±1.87）%，三組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.458、6.230、6.633，P<0.05），見圖1、圖2。

3討論

目前快速建立早期股骨頭壞死動物模型的方法包括激素聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)、異體血清誘導(dǎo)。但是內(nèi)毒素或異體血清雖然能夠誘導(dǎo)股骨頭壞死，加快病程進展，但是費用較為昂貴，同時存在并發(fā)癥。異體血清聯(lián)合激素誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生Ⅲ型過敏反應(yīng)，誘導(dǎo)動脈管腔變窄，減小血流，進而導(dǎo)致骨壞死，但是有可能引起過度免疫反應(yīng)等因素導(dǎo)致動物死亡[8]。常用的內(nèi)毒素是一種強烈的炎性因子，作用于機體后可能頭壞死的發(fā)病機制相似，均為外界干預(yù)后產(chǎn)生脂代謝障礙導(dǎo)致股骨頭內(nèi)微血管內(nèi)血栓形成，進而破壞股會導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，大大增加動物的死亡率[9]，如內(nèi)毒素劑量過低，無法有效形成高血液黏稠度環(huán)境，而劑量過高，則有可能造成內(nèi)毒素血癥，增加動物死亡率[10];研究表明酒精性股骨頭壞死的發(fā)病機制與激素性股骨骨頭血運，導(dǎo)致股骨頭壞死，這與人發(fā)病原因相同。

組織病理學(xué)檢查是診斷骨壞死的金標準，激素性股骨頭壞死的主要病理學(xué)改變是骨陷窩中骨細胞消失或變性壞死。本研究中實驗1、2組骨小梁變細、稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，脂肪細胞明顯增多，空骨陷窩率明顯增加，且高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明實驗1、2組動物模型符合股骨頭缺血性壞死的早期病理特征。

本研究通過聯(lián)合應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及飲用酒制作長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及酗酒狀態(tài)的模型，充分模擬人股骨頭壞死的病因?qū)W，內(nèi)毒素或異體血清雖然可以加速誘導(dǎo)股骨頭壞死，但不能模擬人股骨頭壞死的病因，同時，使用內(nèi)毒素或異體血清可能會導(dǎo)致相關(guān)實驗室檢查指標異常，造成實驗誤差，酒精聯(lián)合糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭壞死，可有效加速股骨頭壞死進展，縮短造模時間，且經(jīng)濟、實用、方便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性較好、可成功誘導(dǎo)出兔早期激素性股骨頭缺血壞死模型，致死率低。不足在于大量酒精灌胃可能致兔急性死亡，應(yīng)注意予以保護胃黏膜治療，降低死亡率;四足動物股骨頭負重方式與人類不同，很難模擬人類股骨頭缺血壞死的全部病理過程，宜選擇2足動物，其股骨頭負重方式與人體生物力學(xué)相似[11]。

綜上所述，采用大量酒精聯(lián)合大量地塞米松可成功構(gòu)建兔早期激素性股骨頭壞死模型，并可以加速其病情進展。

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收稿日期：2020-02-03;修回日期：2020-02-10

編輯/肖婷婷