IL-33、腫瘤微血管密度及淋巴管密度在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及對預(yù)后的影響

陳藝?張騰龍?楊哲?陳玲?田金?王潔?郭成業(yè)

【摘要】目的 研究IL-33在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)差異，分析IL-33與腫瘤間質(zhì)中微血管密度（MVD）、淋巴管密度（LVD）的關(guān)系，探討其與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集125例NSCLC患者的臨床資料及病理標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）檢測患者腫瘤組織及癌旁組織中IL-33、MVD、LVD的表達(dá)情況，分析癌旁組織中低表達(dá)與高表達(dá)IL-33者的臨床病毒特征，隨訪患者生存狀況，采用Cox回歸分析NSCLC患者總生存期（OS）及無進(jìn)展生存期（PFS）的關(guān)系。結(jié)果 NSCLC患者癌旁組織中IL-33免疫組化評分高于腫瘤組織（P < 0.001）。癌旁組織中的MVD和LVD均高于腫瘤組織（P均< 0.001）。與低表達(dá)IL-33者相比，NSCLC患者癌旁組織高表達(dá)IL-33者中低分化者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高者比例較高（P均< 0.05）。癌旁組織內(nèi)IL-33表達(dá)強(qiáng)度與MVD有關(guān)（P < 0.05），與LVD無關(guān)（P > 0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，IL-33、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、臨床T分期與OS有關(guān);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床T分期與PFS有關(guān)（P均< 0.05）。 IL-33高表達(dá)及淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者的OS及PFS均低于IL-33低表達(dá)及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者（P均 < 0.05）。結(jié)論 NSCLC患者癌旁組織IL-33的高表達(dá)與腫瘤微血管生成及NSCLC患者的不良預(yù)后有關(guān)。IL-33高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期晚是NSCLC患者OS的危險(xiǎn)因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期晚是患者PFS預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。

【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌;白介素-33;微血管密度;淋巴管密度;預(yù)后

Effect of expression of interleukin-33， tumor microvascular density and lymphatic vessel density on clinical prognosis of patients with non-small cell lung cancer Chen Yi， Zhang Tenglong， Yang Zhe， Chen Ling， Tian Jin， Wang Jie， Guo Chengye. Qingdao University， Qingdao 266011， China

Corresponding author， Guo Chengye， E-mail： chengye_guo@ 126. com

【Abstract】Objective To compare the interleukin-33 （IL-33）expression between cancer and adjacent tissues in patients diagnosed with non-small cell lung cancer （NSCLC）， analyze the relationship between IL-33， tumor microvascular density （MVD） and lymphatic vessel density （LVD） and investigate the correlation with clinical prognosis. Methods Clinical and pathological data of 125 NSCLC patients were collected. The expression level of IL-33， MVD and LVD in the tumor and adjacent tissues were detected by immunohistochemical staining. Clinical characteristics of patients with low- and high-expression levels of IL-33 in the adjacent tissues were analyzed. The survival status of these patients was followed up. The relationship between these parameters， and overall survival （OS） and progression-free survival （PFS） was investigated by Coxs regression analysis. Results Immunohistochemical staining showed that the expression of IL-33 in the adjacent tissues of NSCLC patients was significantly higher than that in the tumor tissues （P < 0.001）. The MVD and LVD in the adjacent tissues were significantly higher compared with those in the cancerous tissues （both P < 0.001）. The proportion of low/moderate-grade tumor differentiation， lymph node metastasis and advanced clinical T staging in NSCLC patients with high-expression of IL-33 in the adjacent tissues was significantly higher compared with that of their counterparts with low-expression of IL-33 （all P < 0.05）. The expression of IL-33 in the adjacent tissues was significantly correlated with MVD （P < 0.05） rather than LVD （P > 0.05）. Multivariate Coxs regression analysis revealed that IL-33， lymph node metastasis status and clinical T staging were significantly correlated with OS， and lymph node metastasis status and clinical T staging were significantly correlated with PFS （all P < 0.05）. The OS and PFS of patients with high-expression of IL-33 and lymph node metastasis were significantly worse than those with low-expression of IL-33 and no lymph node metastasis （both P < 0.05）. Conclusions High expression levels of IL-33 and the formation of MVD in the adjacent tissues are associated with poor prognosis of NSCLC patients. High expression levels of IL-33， lymph node metastasis and advanced clinical T staging are the independent risk factors of OS of NSCLC patients. Lymph node metastasis and advanced clinical T staging are the independent risk factors of PFS of NSCLC patients.

【Key words】Non-small cell lung cancer;IL-33;Microvascular density;Lymphatic vessel density;

Prognosis

肺癌是全球惡性腫瘤患者的主要死亡原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的85%[1-2]。目前對肺癌的研究已經(jīng)擴(kuò)展到了腫瘤的非癌細(xì)胞成分，包括組成腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)[3]。多項(xiàng)研究顯示，IL-33是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的重要影響因素。IL-33是IL-1超級家族的一員，由Baekkevold等（2003年）發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核，所以也稱為“高內(nèi)皮細(xì)胞來源的核因子”。早期研究表明，IL-33主要通過與生長刺激表達(dá)基因2（ST2）相互作用誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞2（Th2）型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，與之相關(guān)的疾病研究主要包括哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及炎癥性腸病

等[4-6]。ST2是IL-33的相關(guān)受體，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，包括Th2、自然殺傷細(xì)胞（NK）、自然殺傷T淋巴細(xì)胞（NKT）、肥大和樹突狀細(xì)胞等[7]。IL-33既可以作為細(xì)胞內(nèi)的核因子，也可以作為傳統(tǒng)的細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外[8]。它通常從受損的免疫細(xì)胞中釋放出來，以自分泌和旁分泌的方式，發(fā)揮“警報(bào)素”的功能，在2型先天性免疫中扮演重要的角色，是細(xì)胞損傷或細(xì)胞受壓的危險(xiǎn)信號。最近越來越多的研究表明IL-33在致癌過程中有促進(jìn)作用。腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，腫瘤一般是通過直接浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行播散擴(kuò)散。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行播散主要依靠微血管生成來提供豐富的血供以及營養(yǎng)因子作為基礎(chǔ)，因此可以大膽預(yù)測，腫瘤間質(zhì)中微血管密度（MVD）、淋巴管密度（LVD）的表達(dá)可能是升高的。據(jù)此，探究腫瘤間質(zhì)中MVD、LVD的表達(dá)情況對于預(yù)測腫瘤患者預(yù)后有重要的意義。本研究通過檢測NSCLC腫瘤組織間質(zhì)中IL-33、MVD、LVD的表達(dá)并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，期望為NSCLC的診斷和治療開辟新的途徑。

對象與方法

一、研究對象

本研究所選取的125例NSCLC患者，均為2013年6月至2014年6月在青島市市立醫(yī)院胸外科接受肺癌切除術(shù)，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療，術(shù)中切除組織經(jīng)病理活組織檢查（活檢）確診為NSCLC。其中男88例、女37例，年齡44 ～ 77歲;組織學(xué)類型為鱗癌56例、腺癌54例、腺鱗癌15例;美國抗癌聯(lián)合會(huì)（AJCC）第7版TNM分期T1 58例、T2 29例、T3 38例;淋巴結(jié)陽性67例，淋巴結(jié)陰性58例;高分化62例，低分化63例?；颊呔幱陔S訪狀態(tài)，隨訪時(shí)間截至2018年6月30日。每例均同時(shí)取腫瘤組織和手術(shù)切緣處癌旁組織（距離腫塊 2～3 cm），標(biāo)記取部分用40 g/L多聚甲醛固定后用于免疫組織化學(xué)（免疫組化）行過氧化物酶連接（SP）法檢測。本研究經(jīng)青島市市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

二、檢測方法

1. 肺癌組織及癌旁組織中IL-33的表達(dá)檢測

采用免疫組化檢測。取待測組織以石蠟包埋， 常規(guī)切片，厚度4 μm。65℃ 烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%雙氧水中封閉內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)抗原，山羊抗人血清封閉，加小鼠抗人IL-33單克隆抗體（1∶200，購自美國R&D Systems），4℃孵育過夜;洗滌后加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶100，購自美國R&D Systems），室溫孵育30 min;洗滌后，二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素復(fù)染及梯度乙醇脫水干燥、封片，分別在光學(xué)顯微鏡下觀察IL-33蛋白表達(dá)強(qiáng)度、MVD、LVD。以一抗替換為磷酸鹽緩沖液作陰性對照。

2. 結(jié)果判斷

2.1 IL-33蛋白

所有的染色切片都由2位資深病理學(xué)家獨(dú)立評估。計(jì)數(shù)過程由2位病理科醫(yī)師，采取雙盲法對組織切片計(jì)數(shù)，分別取100、200、400倍視野觀察染色標(biāo)本。如2位醫(yī)師計(jì)數(shù)后分組結(jié)果不一致時(shí)，由第3位病理科主任醫(yī)師重新計(jì)數(shù)并分組。以細(xì)胞間質(zhì)見黃色至棕黃色為陽性信號。IL-33免疫組化染色強(qiáng)度和所占細(xì)胞總數(shù)百分比的評估：隨機(jī)選擇10個(gè)視野（200倍），陽性細(xì)胞比例< 5%評0分、陽性細(xì)胞比例6% ～ 25%評1分、陽性細(xì)胞比例26% ～ 50%評2分、陽性細(xì)胞比例51% ～ 75%評3分、陽性細(xì)胞比例> 75%評4分;細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色強(qiáng)度陰性評0分、弱陽性評1分、中度陽性評2分、強(qiáng)陽性評3分?？偟梅钟伤技?xì)胞總數(shù)百分比和強(qiáng)度得分之和，總分0～1分表示為（-）、2 ～ 4分表示為（+）、5 ～ 7分評為

（++） [9]。取10個(gè)區(qū)域的平均值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中（++）定義為高表達(dá)組，（-）或（+）定義為低表達(dá)組。

2.2 MVD

MVD的判定參照Weidner法，鏡下觀察微血管呈棕色（CD34陽性）的單個(gè)或成簇細(xì)胞，低倍鏡（100倍）下選取5個(gè)血管密度最高的視野，并于中倍鏡（200倍）下人工計(jì)數(shù)每個(gè)視野微血管數(shù)，取平均值表示MVD[10]。高值組和低值組以平均值為界限劃分。

2.3 LVD

LVD的判定參照Schoppmann法，鏡下觀察微淋巴管呈棕黃色（D2-40陽性）單個(gè)或成簇內(nèi)皮細(xì)胞，低倍鏡（100倍）下選取5個(gè)包含微淋巴管的視野（包含肌層不予計(jì)算），并于中倍鏡（200倍）下人工計(jì)數(shù)每個(gè)視野微淋巴管數(shù)，取平均值表示LVD[11]。高值組和低值組以平均值為界限劃分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，IL-33在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)比較采用配對t檢驗(yàn)。IL-33表達(dá)與MVD和LVD的關(guān)系采用關(guān)聯(lián)分析。采用Kaplan-Meier法繪制NSCLC患者生存曲線，IL-33表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NSCLC患者總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）的關(guān)系采用log-rank 檢驗(yàn)。采用進(jìn)入法進(jìn)行多因素Cox回歸分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、NSCLC患者癌旁組織與腫瘤組織中IL-33蛋白免疫組化評分、MVD及LVD的比較

1. NSCLC患者癌旁組織與腫瘤組織中IL-33蛋白免疫組化評分的比較

IL-33在NSCLC患者癌旁組織中免疫組化評分為（5.90±0.23）分，高于腫瘤組織的（1.50± 0.17）分（t = 16.500，P < 0.001），見圖1。

2. NSCLC患者癌旁組織與腫瘤組織中MVD和LVD的比較

腫瘤浸潤邊緣的 MVD和LVD最多，并且兩者密度高的病例容易出現(xiàn)脈管內(nèi)癌栓。癌旁組織中的MVD和LVD分別為45.1±19.7和42.5±15.6，高于腫瘤組織的30.4±11.2和21.6±12.3，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為6.185、6.242，P均< 0.001），見圖2、3。

二、NSCLC患者癌旁組織IL-33低表達(dá)與高表達(dá)者的臨床病理特征比較

與低表達(dá)IL-33者相比，NSCLC患者癌旁組織高表達(dá)IL-33者中低分化者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高者比例較高（P均< 0.05），見表1。

三、NSCLC患者癌旁組織中的IL-33表達(dá)強(qiáng)度與MVD和LVD關(guān)系

癌旁組織內(nèi)IL-33表達(dá)強(qiáng)度與MVD有關(guān)（P < 0.05），與LVD無關(guān)（P > 0.05），見表2。

四、NSCLC患者OS和PFS的影響因素分析

單因素Cox回歸分析顯示，IL-33、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、LVD、MVD的表達(dá)與NSCLC患者OS有關(guān)（P均< 0.05）;IL-33、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、LVD、MVD的表達(dá)與NSCLC患者PFS有關(guān)（P均< 0.05）。將所有因素納入進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示IL-33、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、臨床分期與OS有關(guān)（P < 0.05），見表3;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期與PFS有關(guān)（P均< 0.05），見表4。IL-33高表達(dá)及淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者的OS及PFS均低于IL-33低表達(dá)及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者（P均< 0.05），見圖4。

討論

IL-33存在于多種腫瘤組織間質(zhì)以及腫瘤患者的血清中，其表達(dá)呈現(xiàn)多樣化的表現(xiàn)。IL-33在結(jié)直腸癌的癌旁組織、乳腺癌血清以及NSCLC患者血清中均有表達(dá)升高的報(bào)道[12-14]。也有研究證明肝細(xì)胞癌的生長、轉(zhuǎn)移與IL-33密切相關(guān)[15]。但在多發(fā)性骨髓瘤患者中，IL-33血清水平隨著疾病分期的增高有降低的趨勢[16]。在不同的研究中，肺癌患者與健康人群相比，血清中IL-33水平也是有高有低[17]。有研究表明，IL-33與ST2的結(jié)合可導(dǎo)致低轉(zhuǎn)移Lewis肺癌細(xì)胞的程序化死亡，而高轉(zhuǎn)移細(xì)胞并未表現(xiàn)此結(jié)果[18]。盡管如此，IL-33在肺癌組織中是否具有促進(jìn)細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的功能尚不能明確。

IL-33作為細(xì)胞內(nèi)的核因子或細(xì)胞外的細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。從其機(jī)制而言，IL-33通過與受體ST2和IL-1受體協(xié)同蛋白（IL-1RAcP）的結(jié)合，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)MyD88適配器蛋白質(zhì)的招募，激活I(lǐng)L受體相關(guān)激酶1（IRAK1）/IRAK4通路，導(dǎo)致核因子-κB（NF-κB）核易位和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活，從而調(diào)節(jié)NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因

子[19-20]。最近的研究顯示，IL-33是腫瘤進(jìn)展中的重要效應(yīng)因子[21]。另外一種機(jī)制研究顯示，IL-33/ST2通路上調(diào)了肺癌細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1），提高葡萄糖攝取和糖酵解。因此，當(dāng)IL-33/ST2通路被阻斷后，干擾了GLUT1的表達(dá)，抑制了肺癌細(xì)胞中葡萄糖攝取和糖酵解，從而減少了IL-33誘導(dǎo)的肺癌的生長和轉(zhuǎn)移[22]。有學(xué)者用小鼠肺癌轉(zhuǎn)移模型得出，轉(zhuǎn)基因高表達(dá)IL-33進(jìn)行可以減少腫瘤的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入重組的IL-33可以增加腫瘤部位CD8+ T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的浸潤，并能增加CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[23]。人肺癌組織中 IL-33是否也通過增加免疫細(xì)胞浸潤增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，這一點(diǎn)還需進(jìn)一步探究。

本研究顯示，NSCLC患者的癌旁組織IL-33蛋白免疫組化評分高于腫瘤組織，與既往報(bào)道相符[24]。IL-33在癌旁組織中表達(dá)的差異性提示其在腫瘤微環(huán)境中可能具有特殊的作用，現(xiàn)已明確IL-33存在于各種各樣的腫瘤組織間質(zhì)以及腫瘤患者的血清中，其表達(dá)呈現(xiàn)多樣化的表現(xiàn);而且多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)間質(zhì)（癌旁組織）內(nèi)IL-33的表達(dá)情況與多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，本研究重點(diǎn)偏向于癌旁組織內(nèi)的IL-33，探討腫瘤微環(huán)境對腫瘤患者預(yù)后的影響。進(jìn)一步研究顯示，與低表達(dá)IL-33者相比，NSCLC患者癌旁組織高表達(dá)IL-33者中低分化者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高者比例較高。由此可見，NSCLC患者癌旁組織中IL-33的高表達(dá)與腫瘤惡性程度有關(guān)。

MVD標(biāo)記物CD34為105 ～ 120 kD的跨膜細(xì)胞表面糖蛋白，通常選擇性地在造血干/祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。LVD標(biāo)記物D2-40是一種唾液酸糖蛋白，與淋巴管內(nèi)皮上的黏液性跨膜糖蛋白特異性結(jié)合。本研究顯示，NSCLC患者癌旁組織中MVD和LVD均高于腫瘤組織，而且其IL-33表達(dá)與MVD有關(guān)，提示IL-33與NSCLC的腫瘤微血管生成有一定關(guān)系。

本研究的Cox生存分析顯示，癌旁組織IL-33、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、臨床分期與OS有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期與PFS有關(guān)，癌旁組織IL-33高表達(dá)及淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者的OS及PFS均低于IL-33低表達(dá)及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者。結(jié)果提示，NSCLC癌旁組織高表達(dá)IL-33是NSCLC患者不良預(yù)后的重要影響因素。IL-33在肺癌組織中不表達(dá)或者表達(dá)弱陽性，但在癌旁組織中呈現(xiàn)陽性表達(dá)。其原因有可能是高表達(dá)于癌旁組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的IL-33作為一種“警報(bào)素”，從受損的組織細(xì)胞中釋放出來，以自分泌和旁分泌的方式，在Th2型先天性免疫中扮演著重要的角色，但由于復(fù)雜的腫瘤免疫逃逸機(jī)制，隨著腫瘤的進(jìn)展，腫瘤組織中IL-33的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。也有一種可能為IL-33高表達(dá)于一些非免疫細(xì)胞，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)腫瘤組織發(fā)生發(fā)展時(shí)，癌旁組織受壓、損傷，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-33，并作為“警報(bào)素”引發(fā)免疫。但其具體的作用機(jī)制還不確切，需要我們進(jìn)一步探討。這也有可能為NSCLC患者的預(yù)后評估及治療的重要靶點(diǎn)提供了新思路。

日后我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證本研究結(jié)果，判斷IL-33對NSCLC患者的預(yù)后價(jià)值，并擬構(gòu)建IL-33過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染肺癌組織細(xì)胞株，進(jìn)一步檢測IL-33對MVD、LVD的影響，研究其對肺癌組織發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、壞死等影響，更進(jìn)一步探究其相關(guān)機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-10-15）

（本文編輯：林燕薇）