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    mNGS在急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者腦脊液中檢出的DNA病毒特征及臨床意義

    2020-05-25 02:32:31甘周慶楊露王翼潔劉佳陳灼林江瀅李敏彭福華
    新醫(yī)學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:臨床意義腦膜炎腦炎

    甘周慶?楊露?王翼潔?劉佳?陳灼林?江瀅?李敏?彭福華

    【摘要】目的 分析微生物宏基因組二代測序(mNGS)在急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者腦脊液中檢出的DNA病毒特征和臨床意義。方法 對疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎并接受腦脊液mNGS的病例進(jìn)行回顧性分析,按照臨床診斷分組并比較各組檢出的DNA病毒種類、特異序列水平[每1 M序列中的比對序列數(shù)(RPM)]和傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查結(jié)果。結(jié)果 160例疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎的病例分別有30例(18.8%)、85例(53.1%)和45例(28.1%)的臨床診斷為病毒性腦炎或腦膜炎(不能區(qū)分DNA病毒和RNA病毒)、其他感染性腦炎或腦膜炎(細(xì)菌、真菌或寄生蟲)和非感染性腦炎或腦膜炎(免疫炎性、腫瘤等),這3組中分別有8例(26.7%)、30例(35.3%)和8例(17.8%)檢出DNA病毒。病毒性腦炎或腦膜炎組mNGS檢出的病毒均為皰疹病毒,以單純皰疹病毒1型、水痘-帶狀皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒最常見,其RPM有很高的,但大部分均很低,去除RPM≥100的數(shù)據(jù)后,其平均RPM與非感染性腦膜炎組和其他感染性腦膜炎或腦膜炎組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。除了1例有傳統(tǒng)病毒病原學(xué)陽性結(jié)果和1例有很高的RPM支持其致病性,其他均無傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性;而另外2組可以檢出多種DNA病毒,以EB病毒、細(xì)環(huán)病毒和巨細(xì)胞病毒最常見,尤其是其他感染性腦炎或腦膜炎組,它們的平均RPM很低,而且均無傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性。結(jié)論 急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者的腦脊液中皰疹病毒和細(xì)環(huán)病毒等DNA病毒較為常見,尤其是感染性疾病中,mNGS有助于其檢出和診斷,但對于占多數(shù)的RPM較低的結(jié)果,是否有致病性及臨床意義,仍需結(jié)合臨床分析作進(jìn)一步解讀。

    【關(guān)鍵詞】DNA病毒;腦炎;腦膜炎;腦脊液;宏基因組二代測序;臨床意義

    Features and clinical significance of DNA viruses detected by metagenomic Next-generation Sequencing of cerebrospinal fluids in acute or subacute encephalitis or meningitis patients Gan Zhouqing, Yang Lu, Wang Yijie, Liu Jia, Chen Zhuolin, Jiang Ying, Li Min, Peng Fuhua. Department of Neurology, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China

    Corresponding author, Peng Fuhua, E-mail: pfh93@ 163. Com

    【Abstract】Objective To analyse the features and clinical significance of DNA viruses detected by metagenomic Next-generation Sequencing (mNGS) of cerebrospinal fluids (CSF) in acute or subacute encephalitis or meningitis patients.? Methods A retrospective analysis is performed on the cases of acute or subacute encephalitis or meningitis conducted mNGS (based on Illumina MiniSeq system, with reads per million mapped readers (RPM) ≥ 1 as positive for DNA viruses) of CSF, and the viral types and their RPM levels were compared among groups classified according to clinical diagnosis, a composite reference standard.? Results Among 160 cases of suspected encephalitis or meningitis, 30 cases (18.8%), 85 cases (53.1%) and 45 cases (28.1%) were classified into viral encephalitis or meningitis (VEM) group, non-viral infectious encephalitis or meningitis (NVIEM) group and non-infectious encephalitis or meningitis (NIEM) group respectively, and DNA viruses were detected in 8 cases (26.7%), 30 cases (35.3%) and 8 cases (17.8%) of the 3 groups respectively. The DNA viruses in VEM group are all herpesviruses, with human alpha-herpesvirus 1, human alpha-herpesvirus 3 and cytomegalovirus being the most common, and most of them with low RPM, When excluding data with RPM ≥ 100 of this group, there are no significant statical difference among 3 group (P > 0.05). Viruses in this group all had no evidence of traditional viral etiology to support their pathogenicity, with low RPM levels as well, except for one case with positive results of traditional viral etiology and one case with really high RPM level. In contrast, Estein-Barr virus, Torque teno viruses and cytomegalovirus are most frequently seen in the other 2 groups, especially in NVIEM group, with lower RPM levels and without evidence of traditional viral etiology to support their pathogenicity for all cases.? Conclusions DNA viruses like herpesviruses and Torque teno viruses can be commonly seen in CSF of acute or subacute encephalitis or meningitis patients, especially in infectious diseases, mNGS helps with DNA viral detection in CSF, but those results with low RPM levels should be explained under clinical settings.

    【Key words】DNA viruses;Encephalitis;Meningitis;Cerebrospinal fluids;

    Metagenomic Next-generation Sequencing;Clinical significance

    病毒感染是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染類型之一,目前,仍有超過一半的CNS感染無法明確病因[1]。腦脊液微生物宏基因組二代測序(mNGS)是近年發(fā)展起來的基于基因組學(xué)的病原學(xué)檢測技術(shù),基本原理是通過對新鮮樣本(腦脊液等)進(jìn)行高通量測序獲得其所含的微生物的核酸信息,然后與已知病原體基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和分析來確定樣本所含的病原體[2-3]。目前已有一些病例報告或小樣本研究報道其有助于腦脊液中皰疹病毒(HSV)、腸道病毒和一些蟲媒病毒等病毒的檢出,但并未系統(tǒng)討論mNGS檢出的這些DNA病毒的臨床意義,或評估其真實(shí)性[4-8]。因此,本課題組對1年內(nèi)疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎并進(jìn)行腦脊液mNGS(只進(jìn)行DNA提取)的病例進(jìn)行回顧性分析,按照臨床診斷分組,比較各組檢出的DNA病毒種類和特異序列水平,以及探討其臨床意義。

    對象與方法

    一、研究對象

    回顧性收集于2017年10月1日至2018年12月30日在我院住院治療的患者的臨床資料,按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,納入標(biāo)準(zhǔn):①疑診急性或亞急性(病程< 6個月)腦炎或腦膜炎并成功接受腦脊液mNGS;②均按診療常規(guī)完成診治,并接受1 ~ 6個月的隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):①資料不完整或失訪;②確診RNA病毒性腦炎或腦膜炎;③無明確臨床診斷;④處于治療后恢復(fù)期。匯總?cè)虢M患者的基線資料,將這些患者分為病毒性腦炎或腦膜炎、其他感染性腦炎或腦膜炎(細(xì)菌、真菌或寄生蟲)和非感染性腦炎或腦膜炎(免疫炎性、腫瘤等)3組。

    二、mNGS實(shí)驗(yàn)方法

    取200 μl 腦脊液樣本于室溫下以5000轉(zhuǎn)/分離

    心10 min,使用天根DNA提取試劑盒(TIANGEN DNA Mini kit DP316)從腦脊液上清中提取DNA并純化,同時每批測試設(shè)立一個無菌水的陰性對照(NTC),然后通過Qubit和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量,接著參照Illumina公司的文庫構(gòu)建試劑盒(QIAseqTM Ultralow Input Library Kit)操作手冊進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建。將帶有不同索引標(biāo)簽的合格DNA文庫匯集在一起,進(jìn)行擴(kuò)增和富集,然后在Illumina測序平臺(Illumina MiniSeq)進(jìn)行測序。

    三、生物信息學(xué)分析和陽性標(biāo)準(zhǔn)

    測序生成的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過接頭引物、中低質(zhì)量序列和短序列(長度< 50 bp)的過濾后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù),然后使用Burrows-Wheeler比對軟件與人類參考基因組(hg19)比對來過濾掉人源序列[9]。接著把剩余的數(shù)據(jù)與自建的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(從NCBI網(wǎng)站ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/下載,包含了與人類疾病相關(guān)的11 910種細(xì)菌、7103種病毒、1046種真菌和305種寄生蟲的基因組信息)進(jìn)行比對,以得到樣本的微生物組成及相應(yīng)的種或?qū)伲ㄈ绻雌ヅ涞骄唧w物種)水平上的測序深度、覆蓋度和特異序列數(shù),特異序列數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為每1 M序列中的比對序列數(shù)(RPM),并計(jì)算RPM比率(RPM-r),定義為RPMsample/RPMNTC(NTC未檢出時,RPMNTC = 0,RPM-r = RPMsample)。陽性標(biāo)準(zhǔn):對于DNA病毒,RPMsample≥1,且RPM-r > 5或RPMNTC = 0。測序結(jié)果通常在2 ~ 5 d內(nèi)獲得,包括檢出微生物(原核生物、真核生物和DNA病毒)及其RPMsample。

    四、臨床診斷的判斷

    綜合患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室及輔助檢查結(jié)果、治療反應(yīng)和轉(zhuǎn)歸對病例的臨床診斷進(jìn)行確認(rèn),在隨訪結(jié)束后由2名主治醫(yī)師級別以上的醫(yī)師參考相應(yīng)指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行診斷,對意見不統(tǒng)一的病例進(jìn)行討論后確定,其中病毒性腦炎或腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參考既往研究[10]。對臨床診斷的可靠性劃分為4個水平:①確定的,有除mNGS外的病原學(xué)、血清學(xué)或病理等公認(rèn)的確診證據(jù);②很可能的,臨床表現(xiàn)符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn),特異性治療有效,并排除一些相似的疾病,但無確診依據(jù);③可能的,部分臨床表現(xiàn)符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn),特異性治療有效或無效,無確診依據(jù);④無法判斷(這些病例被排除)。

    五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較3組的臨床特征、檢出的DNA病毒種類及其RPM水平,其中分類變量資料使用例數(shù)(百分比)描述,組間比較采用χ2檢驗(yàn),連續(xù)變量使用中位數(shù)(下四分位數(shù),上四分位數(shù))描述,多組間比較使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),α = 0.05(雙側(cè)),兩兩比較使用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水平,α= 0.0167(雙側(cè))。

    結(jié)果

    一、3組腦炎或腦膜炎患者的臨床資料

    共有180例病例符合入選標(biāo)準(zhǔn),共納入160例,分別有30例、85例和45例的臨床診斷為病毒性腦炎或腦膜炎、其他感染性腦炎或腦膜炎和非感染性腦炎或腦膜炎,見圖1。除了性別和mNGS同期腦脊液的紅細(xì)胞水平,其他特征在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均< 0.05),病毒性腦炎或腦膜炎患者的年齡較小,很少使用免疫抑制劑或長期服用糖皮質(zhì)激素(激素),病程短,改良Rankin量表(mRS)評分較低,但采樣前較多已經(jīng)接受阿昔洛韋或利巴韋林抗病毒治療;各組mNGS同期腦脊液的特征亦符合各自常見的腦脊液特征,但病毒性腦炎或腦膜炎和非感染性腦炎或腦膜炎之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.0167),提示臨床上兩者間的鑒別尤為重要[11]。

    二、患者臨床診斷與mNGS結(jié)果匯總

    160例入組病例分別有30例(18.8%)、85例(53.1%)和45例(28.1%)的臨床診斷為病毒性腦炎或腦膜炎[2例確診為單純皰疹病毒1型(HSV-1)性腦炎(圖1a)]、其他感染性腦炎或腦膜炎(42例有傳統(tǒng)病原學(xué)證據(jù)確診)和非感染性腦炎或腦膜炎(14例確診),無病毒與其他微生物的混合感染。這3組病例中分別有8例(26.7%)、30例(35.3%)和8例(17.8%)檢出DNA病毒。病毒性腦炎或腦膜炎組檢出的DNA病毒均為HSV,以HSV-1、HSV-3和巨細(xì)胞病毒(CMV)最常見,但僅1例的傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查陽性(圖1b),1例的RPM很高,考慮有致病性,其他均無傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性。其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出的DNA病毒最常見的是EB病毒(EBV)、細(xì)環(huán)病毒(TTV)和CMV[三者共占93.3%(28/30)];這些病例均確診或臨床診斷為較明確的其他感染性腦炎或腦膜炎(細(xì)菌、真菌和寄生蟲),而且僅1例HBV的同期血清病毒DNA陽性(圖1c),支持合并慢性乙型肝炎活動期的診斷而非HBV性腦炎,均無傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性,因此考慮為非致病性(亞臨床感染?不排除污染可能)。非感染性腦炎或腦膜炎組則檢出各種DNA病毒,除了1例HBV的同期血清病毒DNA陽性(圖1d),均無傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性,考慮非致病性(亞臨床感染?不排除污染可能)。

    三、檢出病毒的RPM

    病毒性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒RPM有很高的也有較低的;而其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒的RPM均較低;非感染性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒的RPM則很低(圖2)。去除病毒性腦炎或腦膜炎組RPM ≥ 100的數(shù)據(jù)后,3組檢出的病毒的RPM比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05,圖2)。

    討論

    腦脊液的mNGS目前已經(jīng)作為慢性或復(fù)發(fā)的腦炎或腦膜炎的一線診斷試驗(yàn)和急性腦炎或腦膜炎的二線診斷試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用[12]。本課題組對我科1年內(nèi)疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎并接受腦脊液mNGS的病例進(jìn)行回顧性分析,綜合分析患者的臨床診斷、傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查結(jié)果、RPM來討論其檢出的DNA病毒的特征以及臨床意義,初步評估其對DNA病毒性腦炎或腦膜炎的診斷價值。

    mNGS相對于傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查的一個顯著優(yōu)勢是一次試驗(yàn)可以同時檢測上千種病毒,甚至不需要依賴臨床預(yù)判,即檢測范圍廣,尤其是在腦脊液獲取困難、資源受限的情況下[2-3, 13]。本研究的結(jié)果顯示mNGS檢出的與臨床診斷一致的,考慮有致病性的DNA病毒主要為各型的HSV,以HSV-1、HSV-3和CMV最常見,這與其他研究類似[4-8]。未發(fā)現(xiàn)其他類型的致病性病毒可能與樣本量過小、流行病學(xué)或病例選擇(較多病例接受抗病毒治療,平均病程也偏長)有關(guān)。由于未進(jìn)行RNA提取,本研究中未檢測RNA病毒,盡管理論上也是可行的[7]。

    本研究中最常見的考慮非致病性的DNA病毒是EBV、TTV、CMV、梅克爾多元癌細(xì)胞病毒(MCPyV)和HBV,并且通常在其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出,其平均RPM水平介于病毒性腦炎或腦膜炎組和非感染性腦炎或腦膜炎組之間。因此,帶來的疑問是,這些在其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒是否是混合感染,我們推測它們可能為潛伏感染、隱性感染或攜帶狀態(tài)等亞臨床感染,當(dāng)然也不排除假陽性(污染)。首先,它們也是其他研究中常見的背景微生物,盡管大部分病例采樣前未接受任何抗病毒治療,以及有較長的病程,它們的平均RPM仍很低,約50%的病例未達(dá)其他研究中較為公認(rèn)的RPM≥3的陽性標(biāo)準(zhǔn)[6,8]。其次,因?yàn)镃NS感染時血腦屏障被破壞或通透性增加,這些病毒核酸也可能是來源于血液,或腦脊液中的白細(xì)胞,如在檢出HBV的患者的血清亦檢測到很高水平的HBV DNA,這種情況更傾向于考慮合并慢性乙型肝炎(活動期),因?yàn)镠BV不在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。本研究中檢出的各種非致病性的DNA病毒均可在健康人的血液中通過mNGS檢測到,尤其是TTV、EBV和CMV[14]。超過90%的人群有EBV或CMV的淋巴細(xì)胞的潛伏感染,敗血癥等重癥患者的EBV、CMV、HSV-1和HHV-6再激活率分別達(dá)48%、18%、26%和24%[15]。既往研究也顯示,在多種非病毒性CNS感染患者甚至非感染性疾病患者的腦脊液中通過PCR發(fā)現(xiàn)低水平的DNA或RNA病毒[16-17]。再者,除了HBV,這些mNGS檢測到的DNA病毒未對診治流程產(chǎn)生影響,也因此導(dǎo)致多數(shù)病例未進(jìn)行相應(yīng)的傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查。急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者的腦脊液中HSV和TTV等DNA病毒較為常見,尤其是感染性疾病中,HBV的例子說明我們在臨床工作中應(yīng)重視對這些RPM較低的結(jié)果的進(jìn)一步解讀來明確其臨床意義。

    RPM反映檢測到的病毒的序列數(shù)或相對豐度(半定量),既往研究已顯示其不一定與病毒負(fù)荷成比例,也不一定反映疾病嚴(yán)重性[7]。我們的研究顯示,mNGS檢出的DNA病毒的RPM越高,其診斷意義可能越高,特別是RPM≥100時,幾乎排除了非致病性,而RPM較低(RPM < 100)時可能是非致病性的,其臨床意義需結(jié)合臨床判斷。此外,由于大部分病例未進(jìn)行嚴(yán)格的同期傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查,假陽性的情況不能評估,即使是病毒性腦炎或腦膜炎組檢出的較低RPM的病毒,也可能是非致病性的。mNGS的陽性界限和真實(shí)性仍有待明確,本研究的結(jié)果有助于指導(dǎo)進(jìn)一步的對比研究。

    總之,mNGS檢測范圍廣和無需臨床預(yù)判的優(yōu)點(diǎn)使得其檢出率可能優(yōu)于傳統(tǒng)方法,有助于腦脊液中DNA病毒的檢出和診斷,但對于占多數(shù)的RPM較低的結(jié)果,是否有致病性和臨床意義,仍需結(jié)合臨床分析和進(jìn)一步解讀。當(dāng)然,本研究為回顧性分析,存在病例選擇偏倚,未與傳統(tǒng)方法比較等不足,仍需更多研究來明確mNGS檢測DNA病毒的陽性界限和評價真實(shí)性,以及改進(jìn)方法以檢測RNA病毒。

    參 考 文 獻(xiàn)

    [1] Khatib U, van de Beek D, Lees JA, Brouwer MC. Adults with suspected central nervous system infection: a prospective study of diagnostic accuracy. J Infection, 2017, 74(1): 1-9.

    [2] Wilson MR, Naccache SN, Samayoa E, Biagtan M, Bashir H, Yu G, Salamat SM, Somasekar S, Federman S, Miller S, Sokolic R, Garabedian E, Candotti F, Buckley RH, Reed KD, Meyer TL, Seroogy CM, Galloway R, Henderson SL, Gern JE, DeRisi JL, Chiu CY. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. New Engl J Med, 2014, 370(25): 2408-2417.

    [3] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, Messacar K, Arevalo S, Federman S, Stryke D, Pham E, Fung B, Bolosky WJ, Ingebrigtsen D, Lorizio W, Paff SM, Leake JA, Pesano R, DeBiasi R, Dominguez S, Chiu CY. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid. Genome Res, 2019, 29(5): 831-842.

    [4] Zanella M, Lenggenhager L, Schrenzel J, Cordey S, Kaiser L. High-throughput sequencing for the aetiologic identification of viral encephalitis, meningoencephalitis, and meningitis. A narrative review and clinical appraisal. Clin microbiol infect, 2019, 25(4): 422-430.

    [5] Zhang J, Zheng P, Sun H, Dong J, Li S, Fan S, Ren H, Wu H, Guan H, Chen Q. Next-generation sequencing combined with routine methods to detect the pathogens of encephalitis/meningitis from a Chinese tertiary pediatric neurology center. J Infection, 2019, 78(5): 409-421.

    [6] Wilson MR, Sample HA, Zorn KC, Arevalo S, Yu G, Neuhaus J, Federman S, Stryke D, Briggs B, Langelier C, Berger A, Douglas V, Josephson SA, Chow FC, Fulton BD, DeRisi JL, Gelfand JM, Naccache SN, Bender J, Dien Bard J, Murkey J, Carlson M, Vespa PM, Vijayan T, Allyn PR, Campeau S, Humphries RM, Klausner JD, Ganzon CD, Memar F, Ocampo NA, Zimmermann LL, Cohen SH, Polage CR, DeBiasi RL, Haller B, Dallas R, Maron G, Hayden R, Messacar K, Dominguez SR, Miller S, Chiu CY. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. New Engl J Med, 2019, 380(24): 2327-2340.

    [7] Edridge AWD, Deijs M, van Zeggeren IE, Kinsella CM, Jebbink MF, Bakker M, van de Beek D, Brouwer MC, van der Hoek L. Viral metagenomics on cerebrospinal fluid. Genes (Basel), 2019, 10(5): e332.

    [8] Kufner V, Plate A, Schmutz S, Braun DL, Gunthard HF, Capaul R, Zbinden A, Mueller NJ, Trkola A, Huber M. Two inical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encases. Genes (Basel), 2019, 10(9): e661.

    [9] Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics, 2009, 25(14): 1754-1760.

    [10] Ai J, Xie Z, Liu G, Chen Z, Yang Y, Li Y, Chen J, Zheng G, Shen K. Etiology and prognosis of acute viral encephalitis and meningitis in Chinese children: a multicentre prospective study. Bmc Infect Dis, 2017, 17(1): 494.

    [11] van Swieten JC, Koudstaal PJ, Visser MC, Schouten HJ, van Gijn J. Interobserver agreement for the assessment of handicap in stroke patients. Stroke, 1988, 19(5): 604-607.

    [12] Brown JR, Bharucha T, Breuer J. Encephalitis diagnosis using metagenomics: application of next generation sequencing for undiagnosed cases. J Infection, 2018, 76(3): 225-240.

    [13] Moustafa A, Xie C, Kirkness E, Biggs W, Wong E, Turpaz Y, Bloom K, Delwart E, Nelson KE, Venter JC, Telenti A. The blood DNA virome in 8,000 humans. Plos Pathog, 2017, 13(3): e1006292.

    [14] 丁文,黃杏芬,薛慶歡,吳小佳,曾廣旦. 近三年超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌檢測及耐藥性變遷分析. 中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版), 2008,29(35):155-158.

    [15] Ong DSY, Bonten MJM, Spitoni C, Verduyn Lunel FM, Frencken JF, Horn J, Schultz MJ, van der Poll T, Klein Klouwenberg PMC, Cremer OL. Epidemiology of multiple herpes viremia in previously immunocompetent patients with septic shock. Clin infect dis, 2017, 64(9): 1204-1210.

    [16] Weinberg A, Bloch KC, Li S, Tang Y, Palmer M, Tyler KL. Dual infections of the central nervous system with Epstein-Barr virus. J infect dis, 2005, 191(2):234-237.

    [17] Van Koningsveld R, Schmitz PIM, Ang CW, Groen J, Osterhaus ADME, Van der Meche FGA, Van Doorn PA. Infections and course of disease in mild forms of Guillain-Barre syndrome. Neurology, 2002, 58(4):610-614.

    (收稿日期:2019-12-15)

    (本文編輯:洪悅民)

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