抗病毒感冒顆粒質(zhì)量標準研究

徐媛 張婷婷 張瑞濤 吳丹 黨學良 劉梅 張琰

[摘要] 目的 建立抗病毒感冒顆粒的質(zhì)量標準，更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，為臨床安全應用提供保障。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對抗病毒感冒顆粒中的柴胡、忍冬藤、板藍根進行定性鑒別。采用高效液相色譜法對忍冬藤主要有效成分馬錢苷進行含量測定，以ODS-3為色譜柱，乙腈-水（12∶88）為流動相，檢測波長236 nm。 結果 TLC斑點清晰、分離度好、專屬性強、陰性對照無干擾;馬錢苷在4.72～236.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系（r = 0.9999），平均回收率為100.57%，RSD值為1.19%（n = 6），3批抗病毒感冒顆粒含量測定結果分別為0.4335、0.3741、0.3142 mg/g。 結論 所建立的定性、定量方法準確、可靠、重復性好，可作為抗病毒感冒顆粒的質(zhì)量控制方法。

[關鍵詞] 抗病毒感冒顆粒;質(zhì)量標準;薄層色譜法;高效液相色譜法

[中圖分類號] R282 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（c）-0014-04

Quality standard for Kangbingduganmao Granules

XU Yuan ? ZHANG Tingting ? ZHANG Ruitao ? WU Dan ? DANG Xueliang ? LIU Mei ? ZHANG Yan

Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Air Force Medical University， Shaanxi Province， Xi′an ? 710038， China

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Kangbingduganmao Granules， to better control the product quality and to provide guarantee for clinical safety application. Methods Bupleuri Radix， Lonicerae Japonicae Caulis and Isatidis Radix in Kangweiganmao Granules were identified qualitatively by thin layer chromatography （TLC）. The content of loganin， the main effective component of Lonicerae Japonicae Caulis was determined by high performance liquid chromatography. The ODS-3 was used as the column and acetonitrile-water （12∶88） was used as the mobile phase， the detection wavelength was 236 nm. Results TLC spots were clear， the resolution was good， specificity was strong， and negative control had no interference. The loganin in the range of 4.72-236.00 μg/mL showed good linear relationship with the peak area （r = 0.9999）. The average recovery rate was 100.57% and RSD was 1.19% （n = 6）. The determination results of three batches of samples were 0.4335， 0.3741 and 0.3142 mg/g respectively. Conclusion The established qualitative and quantitative methods are accurate， reliable and reproducible， and can be used as quality control methods for antiviral cold granules.

[Key words] Kangbingduganmao Granules; Quality standard; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

抗病毒感冒顆粒為柴胡、忍冬藤、板藍根、石膏、大青葉等中藥經(jīng)提取制得的顆粒劑，具有清熱解毒、清肺止咳的功效，用于病毒性感冒。抗病毒感冒顆粒是空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，已應用于臨床多年，療效顯著。原質(zhì)量標準僅對處方中黃芩進行薄層色譜鑒別，且鑒別方法重復性差。為控制制劑質(zhì)量，保證用藥安全，對制劑質(zhì)量標準進行研究。本研究對君藥忍冬藤中主要功效成分馬錢苷進行高效液相色譜法含量測定，對君藥忍冬藤、臣藥柴胡、板藍根進行薄層鑒別，并參照“藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”[1]。對薄層鑒別及含量測定方法進行方法學驗證。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Agilent 1260型）;電子天平（Sartorius，CP225D，精密度十萬分之一）;超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，KH5200DB）。

馬錢苷、柴胡皂苷a、R，S-告依春、板藍根對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：111640-201005、110777-201711、111753-201706、121177-201608）;抗病毒感冒顆粒（空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院藥劑科制備，規(guī)格：10 g/袋，批號：20171015、20171016、20171017）。硅膠G薄層板（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，絳綸片基，規(guī)格10 cm×10 cm;青島海浪硅膠干燥劑有限公司，玻璃片基，規(guī)格：100 mm×100 mm;厚度：0.20～0.25 mm;青島海洋化工廠分廠，玻璃片基，規(guī)格：100 mm×100 mm;厚度：0.20～0.25 mm）;甲醇（Honeywell，色譜純）;水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 忍冬藤、柴胡 ?取本品20 g，加水飽和正丁醇100 mL，超聲30 min，濾過，濾液加氨試液洗滌兩次，每次50 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解。另取馬錢苷及柴胡皂苷a對照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升分別含1、0.5 mg的對照溶液。用薄層色譜法鑒別，分別吸取上述兩種溶液各20 μL，點于硅膠G薄層板上，展開劑為二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（30∶40∶22∶10）放置后的下層溶液。取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰顯色。供試品溶液在與對照品溶液相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無此斑點。見圖1～2。

1：馬錢苷;2～4：抗病毒感冒顆粒供試品;5：缺忍冬藤的陰性供試品

圖1 ? 忍冬藤薄層色譜圖

2.1.2 板藍根 ?取本品20 g，加水100 mL，超聲30 min，搖勻，3000 r/min離心3 min，取上清液，加乙酸乙酯振搖提取兩次，每次20 mL，乙酸乙酯液合并，旋蒸至干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取板藍根對照藥材1 g，按供試品溶液制備法操作，作為對照藥材溶液。再取R，S-告依春對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液作為對照品溶液。采用薄層色譜法，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點于硅膠GF254薄層板上，展開劑為石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）。取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下進行檢視。供試品溶液在與對照藥材及對照品溶液相應的位置上顯相同的熒光斑點，陰性對照無此斑點。見圖3。

1：R，S-告依春;2：板藍根對照藥材;3～5：抗病毒感冒顆粒供試品;6：缺板藍根的陰性供試品

圖3 ? 板藍根薄層色譜圖

2.2 馬錢苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 ?色譜柱：Inertsil ODS-3（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流動相：乙腈-水（12∶88）等度洗脫;檢測波長：236 nm;流速：1.0 mL/min。

2.2.2 溶液配置 ?對照品溶液：取馬錢苷對照品適量，加甲醇制成20 μg/mL的溶液，即得。

供試品溶液：取本品3 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水40 mL，超聲30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，3000 r/min離心3 min，取上清液10 mL，加入大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.2 cm，柱高為10 cm），以100 mL水洗脫，棄去水液，繼用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，即得。

陰性對照溶液：取不含馬錢藥材的陰性對照顆粒3 g，按供試品溶液制備方法操作，即得。

2.2.3 專屬性實驗 ?按照“2.2.1”項下色譜條件，取“2.2.2”項下3種溶液分別進樣10 μL測定，得到色譜圖。見圖4。圖中馬錢苷與其他成分分離度良好（分離度>1.5），保留時間約為17 min，且陰性對照溶液在相同保留時間處未見明顯干擾色譜峰。

①：對照品溶液;②：供試品溶液;③：陰性對照溶液

圖4 ? 馬錢苷HPLC譜圖

2.2.4 標準曲線的制備 ?取馬錢苷對照品11.8 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制濃度為236.00 μg/mL的馬錢苷對照品儲備液。吸取上述對照品儲備液適量，加甲醇稀釋至濃度分別為4.72、9.44、23.60、47.20、118.00 μg/mL的系列對照品溶液。精密吸取各濃度的對照品溶液各10 μL，分別進樣測定。以峰面積（A）對濃度（C）做線性回歸，得到標準曲線方程：A =21.7652 C+36.8343（r = 0.9999）。提示馬錢苷在4.72～236.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.5 精密度實驗 ?按“2.2.2”項下方法制備對照品溶液及供試品溶液，重復進樣6次，記錄峰面積，計算供試品中馬錢苷的含量，計算精密度。結果顯示，馬錢苷含量測定的精密度RSD分別為0.28%、0.78%，該儀器精密度良好。

2.2.6 中間精密度實驗 ?取同一批次（批號：20151016）抗病毒感冒顆粒，由不同分析人員于不同日期分別按“2.2.2”項下方法制備對照品溶液及供試品溶液，進樣測定并計算馬錢苷含量，測定6次，計算得平均含量為0.4335 mg/g，測定結果RSD為0.97%，中間精密度良好。

2.2.7 回收率實驗 ?取馬錢苷對照品，加甲醇制成濃度為660.80 μg/mL的對照品溶液。取同一批次（批號：20151016）抗病毒感冒顆粒（其中馬錢苷含量為0.4335 mg/g）9份，每份1.5 g，精密稱定。分別精密加入濃度為660.80 μg/mL的對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL各3份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制成加樣回收供試品溶液，測定馬錢苷含量，計算得平均回收率為100.57%，RSD為1.19%。見表1。

表1 ? 加樣回收率實驗結果

2.2.8 穩(wěn)定性實驗 ?按“2.2.2”項下方法制備對照品溶液及供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定峰面積。計算得RSD分別為1.96%、1.12%。對照品溶液及供試品溶液在配置后24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.9 樣品含量測定 ?取3批抗病毒感冒顆粒，測定并計算馬錢苷的含量。見表2。

表2 ? 3批抗病毒感冒顆粒測定

2.2.10 含量限度的制訂 ?《中華人民共和國藥典》[2]一部規(guī)定忍冬藤中馬錢苷含量不得低于0.10%，制劑中忍冬藤經(jīng)提取后入藥。按“如所測成分的原料在制備工藝中經(jīng)溶劑提取，該成分轉移率一般應不低于30%”的標準，計算得制劑中馬錢苷含量應不得低于0.6 mg/袋。故制訂本品含量限度為：本品每袋含忍冬藤以馬錢苷（C17H26O10）計，不得少于0.6 mg。計算方法如下：0.1%×2000 g×30%/1000 袋=0.6 mg/袋。

3 討論

3.1 柴胡、忍冬藤薄層鑒別

君藥忍冬藤功效清熱解毒，疏風通絡，具有抗病毒作用[3];臣藥柴胡功效疏肝解郁退熱，具有解熱抗炎作用[4]。忍冬藤、柴胡主要功效成分均為皂苷類，《中華人民共和國藥典》[2]中分別對忍冬藤中馬錢苷及柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d進行鑒別。參考藥典及文獻[2，6-9]，對供試品分別采用50%甲醇超聲、甲醇超聲提取，并進行5%濃氨甲醇除雜、正丁醇萃取、氧化鋁柱富集、大孔樹脂柱富集，均無法得到清晰斑點[5]。以正丁醇超聲提取，氨試液洗滌凈化，可同時得到柴胡皂苷a及馬錢苷斑點?？赡芤虿窈碥誨經(jīng)長時間受熱水解開環(huán)生成柴胡皂苷b1、b2無法檢測到[10-11]，故僅對柴胡皂苷a及馬錢苷進行鑒別，方法操作簡單，斑點清晰。經(jīng)對多種展開劑進行比較，最終確定以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（30∶40∶22∶10）放置后的下層溶液為展開劑，可將多種皂苷成分清晰分離。

3.2 板藍根薄層鑒別

板藍根、大青葉功能清熱解毒，具有抗病原微生物作用[12-14]。此二藥化學成分類似，主要含靛玉紅、靛藍及氨基酸類成分[15-17]。經(jīng)多種試驗方法研究[17]，二者相互干擾，無法對這些成分進行鑒別。后對板藍根中具有抗流感病毒作用的特征性成分（R，S）-告依春進行鑒別研究[18-20]，分別對乙酸乙酯、甲醇、80%甲醇、水提取，經(jīng)大孔樹脂、中性氧化鋁富集，以不同濃度乙醇洗脫進行比較優(yōu)選[21]，最終以水提取，乙酸乙酯萃取，得到滿意效果。

3.3 薄層鑒別方法學驗證

實驗中對不同供試品前處理方法、提取時間、提取次數(shù)、萃取次數(shù)、展開劑條件進行了比較研究，對溶液穩(wěn)定性（24 h）進行了考察，對不同品牌薄層板（臺州、海洋、海浪）、不同展開溫度（4℃、25℃、45℃）、不同展開濕度（32%、45%、88%）進行比較研究，最終確定薄層鑒別方法。

3.4 馬錢苷含量測定

《中華人民共和國藥典》[2]中忍冬藤含量測定指標為馬錢苷，本研究參考藥典對馬錢苷進行含量測定。分別采用比較試驗，對供試品提取溶劑（甲醇、80%甲醇、30%甲醇、70%乙醇、30%乙醇）、提取方法（超聲、回流、浸泡）、溶劑用量、提取時間進行優(yōu)選，對提取液凈化方法，大孔樹脂吸附水、70%乙醇洗脫量進行比較，最終確定供試品制備方法。藥典中采用乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動相，實驗中與乙腈-水（12∶88）進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種流動相無顯著差別，故確定選用后者。

采用耐用性實驗，對流動相比例（12∶88、10∶90、15∶85）、柱溫（2±5）℃、流速（1.0±0.1）mL/min、檢測波長（227±1）nm、色譜柱（Inertsil ODS-3、Agilent SB C18）進行比較，結果所得色譜峰分離度均良好，含量RSD分別為0.60%、1.72%、1.11%、0.46%、0.67%。提示該方法在測定條件有小的變動時，測定結果無顯著差異，系統(tǒng)適應性良好。

[參考文獻]

[1] ?中華人民共和國藥典[S].2015年版.四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社：57-59，59-61，371-373.

[2] ?中華人民共和國藥典[S].2015年版.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社：21，94-95，193，205，224，280.

[3] ?魯思愛.忍冬藤的化學成分及其藥理應用研究進展[J].臨沂大學學報，2012，34（3）：132-134.

[4] ?顏美玲，楊柳，侯阿嬌，等.柴胡化學成分及藥理作用研究進展[J].中醫(yī)藥信息，2018，35（5）：103-109.

[5] ?馬云，王堯堯，張玉，等.金銀花、忍冬藤藥材質(zhì)量標準研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2018，20（8）：70-77.

[6] ?馬杰，孫焱，丁野，等.復方石淋通膠囊質(zhì)量標準的修訂研究[J].中國藥師，2015，18（8）：1284-1286.

[7] ?郭靜，周春玲.口腔炎噴霧劑的質(zhì)量標準研究[J].中國藥師，2013，16（3）：376-378.

[8] ?徐英輝，申茹，郭玉巖.忍冬藤膠囊的制備及其質(zhì)量標準[J].中成藥，2019，41（8）：1790-1794.

[9] ?高輝，于英俊，沈濤，等.忍冬藤飲片質(zhì)量標準研究[J].藥學研究，2018，37（6）：332-334，364.

[10] ?賴克道，劉元，文志云，等.薄層色譜法定性鑒別小柴胡顆粒中的柴胡、甘草[J].廣西醫(yī)學，2009，31（6）：886-887.

[11] ?郭智，彭冰，李宗陽，等.UPLC-QTof -MS測定不同提取條件下柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的轉化規(guī)律[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2014，26：716-720.

[12] ?王建敏，李偉.板藍根顆粒中有效成分的測定及藥理作用研究進展[J].中國醫(yī)藥導報，2019，16（18）：49-52.

[13] ?楊春風，孔慶耀，孫銘君.淺談大青葉的研究進展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（5）：78-80.

[14] ?羅芬.大青葉水提物抗甲型流感病毒活性研究[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2017，34（10）：881-884.

[15] ?黃遠，李菁，徐科一，等.板藍根抗流感病毒有效成分研究進展[J/OL].中國現(xiàn)代應用藥學，2019，36（20）：2618-2623.

[16] ?劉富康，方士元，曲映紅.大青葉粗黃酮提取及其抑菌性研究[J].山東化工，2018，47（21）：34-35，38.

[17] ?閆峻，顧娟，馮碩，等.大青葉化學成分及抗氧化活性研究[J].質(zhì)譜學報，2019，40（4）：381-390.

[18] ?彭婷婷，江勛，周峰.復方板藍根顆粒及板藍根的質(zhì)量研究概況[J].中成藥，2017，39（12）：2573-2575.

[19] ?華之卉，劉棟，李明春.雙波長HPLC法同時測定板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸的含量[J].中國藥房，2017，28（27）：3853-3855.

[20] ?肖雪，馬晉芳，羅國安.HPLC法測定板藍根中抗病毒化學物質(zhì)組的含量[J].江西中醫(yī)藥，2018，49（11）：67-69.

[21] ?莫迎.不同的提取方法對板藍根中（R，S）告依春的影響[J].中醫(yī)藥導報，2011，17（6）：89-91.

（收稿日期：2019-09-30 ?本文編輯：劉永巧）