miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肥胖膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜炎癥水平相關(guān)性研究

李建偉 張麗娜 張英民 康少英 魏萌

[摘要] 目的 研究滑膜組織miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化狀態(tài)與肥胖膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）關(guān)節(jié)液促炎因子水平相關(guān)性。 方法 KOA患者滑膜組織及關(guān)節(jié)液取自2018年1月～2019年1月于河北省邯鄲市中心醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換的36例患者，體重指數(shù)（BMI）≥28.0 kg/m2的患者納入肥胖組（23例），18.0 kg/m2≤BMI≤23.9 kg/m2的患者納入正常對(duì)照組（13例）。甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)滑膜組織miR-203的基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)miR-203在滑膜組織的表達(dá)水平;應(yīng)用qPCR檢測(cè)miR-203在肥胖組和正常對(duì)照組中的表達(dá)水平;采用Pearson相關(guān)分析探討miR-203與BMI，關(guān)節(jié)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的相關(guān)性。 結(jié)果 肥胖組滑膜組織中miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)呈異常低甲基化狀態(tài)，正常對(duì)照組則呈部分低甲基化狀態(tài)。與正常對(duì)照組比較，肥胖組滑膜組織中miR-203的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。肥胖組關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNFα的相對(duì)表達(dá)均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與人群BMI和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α均呈負(fù)相關(guān)（均P < 0.05）;miR-203表達(dá)水平和與人群BMI和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)（均P < 0.05）。 結(jié)論 KOA患者滑膜組織miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化與肥胖KOA患者BMI及關(guān)節(jié)液促炎因子水平密切相關(guān)，miR-203可作為肥胖KOA炎癥的重要調(diào)控因素及KOA治療的潛在靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 肥胖;膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;微小RNA; miR-203;甲基化

[中圖分類號(hào)] R684.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）04（c）-0032-05

Study on the correlation between the methylation of miR-203 gene promoter region and the level of synovitis in obese patients with knee osteoarthritis

LI Jianwei1 ? ZHANG Li′na2 ? ZHANG Yingmin1 ? KANG Shaoying1 ? WEI Meng1

1.Department of Orthopedics， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan ? 056000， China; 2.Department of Cardiology， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan ? 056000， China

[Abstract] Objective To study the correlation between abnormal methylation of miR-203 gene promoter region in synovial tissues and the level of joint fluid proinflammatory factors in obese knee osteoarthritis （KOA）. Methods Synovial tissue and joint fluid of KOA patients were taken from 36 patients who underwent knee arthroplasty in Handan Central Hospital in Hebei Province from January 2018 to January 2019. Patients with body mass index （BMI）≥28.0 kg/m2 were included in the obesity group （23 cases）， and patients with 18.0 kg/m2≤BMI≤23.9 kg/m2 were included in the normal control group （13 cases）. Methylation specific PCR （MSP） was used to detect the methylation status of the gene promoter region of miR-203 in synovial tissues. The expression level of miR-203 in synovial tissues was determined by quantitative polymerase chain reaction （qPCR）. qPCR was used to detect the expression levels of miR-203 in the obese group and the normal control group. Pearson correlation analysis was used to investigate the correlation between miR-203 and BMI， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6） in joint fluid. Results In the synovial tissues of the obese group， the promoter region of miR-203 gene was abnormally hypomorphic， while in the normal control group， it was partially hypomorphic. Compared with the normal control group， the expression level of miR-203 in synovial tissues of the obesity group was increased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The relative expressions of IL-1β， IL-6 and TNF-α in the joint fluid of the obese group were higher than those of the normal control group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. The methylation level in the promoter region of miR-203 gene was negatively correlated with population BMI and the IL-1β， IL-6 and TNF-α in the joint fluid （all P < 0.05）. The expression level of miR-203 was positively correlated with population BMI and the IL-1β， IL-6 and TNF-α in the joint fluid （all P < 0.05）. Conclusion Hypophalation of miR-203 gene promoter in synovial tissues of KOA patients is closely related to BMI and levels of joint fluid proinflammatory factors in obese KOA patients， and miR-203 can be used as an important regulatory factor for inflammation of obese KOA and a potential target for treatment of KOA.

[Key words] Obesity; Knee osteoarthritis; microRNA; miR-203; Methylation

肥胖誘導(dǎo)包括膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）在內(nèi)多種疾病[1]，而且肥胖患者體內(nèi)炎性因子失衡很可能與KOA的發(fā)生相關(guān)。研究表明，膝關(guān)節(jié)滑膜組織釋放的炎性因子升高能引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)退變[2]。另外，微小RNA（microRNA，miRNA）的基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化狀態(tài)在多種疾病中起重要的作用[3]。miR-203在脂肪代謝及軟骨細(xì)胞的炎性損傷中扮演重要調(diào)控角色[4]，且已有研究表明miR-203啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑膜炎癥密切相關(guān)[5]。然而，少見miR-203在KOA疾病和肥胖相關(guān)疾病中的研究。本研究初步研究了肥胖KOA患者滑膜組織中miR-203的基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化狀態(tài)分別與KOA患者體重指數(shù)（body mass index，BMI）、滑膜腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的相關(guān)性。為進(jìn)一步探討miR-203在肥胖KOA中的作用與機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

KOA患者滑膜組織及關(guān)節(jié)液取自河北省邯鄲市中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）于2018年1月～2019年1月行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換的36例K-L評(píng)分Ⅳ級(jí)的KOA患者。按照2003年中國(guó)肥胖工作組制定的《中國(guó)成人超重和肥胖癥預(yù)防和控制指南》[7]的建議，將BMI≥28.0 kg/m2的患者納入肥胖組，18.0 kg/m2≤BMI≤23.9 kg/m2的患者納入正常對(duì)照組。其中正常對(duì)照組13例，肥胖組23例。組織及關(guān)節(jié)液RNA穩(wěn)定試劑處理后，-80℃保存。KOA的診斷符合《骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2018年版）》的KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。所有患者簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA提取和重亞硫酸鹽修飾

應(yīng)用Universal GenomicDNA Extraction KitVer 3.0試劑盒（TaKaRa Bio Inc.;貨號(hào)：DV811A）提取滑膜組織的DNA。紫外-可見分光光度法測(cè)定DNA純度（1.8

1.3 甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP）

The University of California，Santa Cruz′s Genome Technology Center用來搜索miR-203的基因序列。應(yīng)用Methprimer （http：//www.urogene.org/index.html）掃描miR-203的基因序列發(fā)現(xiàn)4個(gè)CpG島。BDGP（http：//fruitfy.org：9005/seq_tools/promoter.html）掃描miR-203的基因序列發(fā)現(xiàn)3個(gè)啟動(dòng)子區(qū)評(píng)分>0.9，分別位于115～173、941～977、1726～1736 bp。經(jīng)過對(duì)比，確定胞嘧啶—磷酸—鳥嘌呤（CpG）島位于miR-203的基因啟動(dòng)子區(qū)[8]。

甲基化產(chǎn)物長(zhǎng)度124 bp，非甲基化產(chǎn)物長(zhǎng)度125 bp。反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用TaKaRa Taq Hot Start Version試劑盒（Takara Bio Inc.;貨號(hào)：DR007A）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min;94℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);72℃孵育10 min。結(jié)果觀察：5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色后于紫外線照射下直接觀察。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

按TianGen試劑盒說明書步驟提取滑膜組織總RNA，抽提好的RNA按照TaKaRa（PrimeScript@RT reagent kit;貨號(hào)：RR047A）試劑盒的反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4℃保存。參照Power UpTM。SYBR Green Master Mix PCR試劑盒（Thermo Fisher Scientific;貨號(hào)：4309155）說明，以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行miR-203的定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算，以人U6基因作為內(nèi)參，計(jì)算miR-203的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

按照制造商的說明書使用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定（R&DSystems，Minneapolis，MN）關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用兩樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析法對(duì)miR-203表達(dá)量（2-ΔΔCt）與BMI、IL-1β、IL-6、TNF-α進(jìn)行相關(guān)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本情況比較

共納入KOA患者共36例，肥胖組中男11例，女12例;正常對(duì)照組中男6例，女7例。兩組患者男女比例、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;兩組患者BMI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.000）。見表1。

表1 ? 兩組患者基本情況比較（x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05;BMI：體重指數(shù)

2.2 肥胖KOA患者滑膜組織中miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)呈異常低甲基化狀態(tài)

肥胖組滑膜組織中miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)呈異常低甲基化狀態(tài)，正常對(duì)照組則呈部分低甲基化狀態(tài)。見圖1。

M：高甲基化;U：低甲基化

圖1 ? 滑膜組織中甲基化特異性PCR反應(yīng)結(jié)果

2.3 miR-203在KOA患者滑膜組織中表達(dá)情況

肥胖組滑膜組織中miR-203的表達(dá)水平（4.56±0.26）高于正常對(duì)照組滑膜組織中miR-203的表達(dá)水平（1.00±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 49.891，P = 0.000）。

2.4 兩組患者關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平比較

肥胖組關(guān)節(jié)液中IL-1β，IL-6，TNFα的相對(duì)表達(dá)均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

表2 ? 兩組患者關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平比較（x±s）

注：IL-1β：白細(xì)胞介素-1β;IL-6：白細(xì)胞介素-6;TNF-α：腫瘤壞死因子-α

2.5 滑膜組織中miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和miR-203水平與關(guān)節(jié)液中促炎因子相關(guān)性

miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與人群BMI和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α均呈負(fù)相關(guān)（均P < 0.05）;miR-203表達(dá)水平和與人群BMI和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)（均P < 0.05）。見表3。

3 討論

肥胖是一種機(jī)體脂肪組織總含量過多和局部含量增多及分布異常的慢性代謝性疾病。肥胖脂肪組織中的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α升高[9-10]。有學(xué)者認(rèn)為，肥胖是一種“慢性低度炎癥狀態(tài)”，可誘導(dǎo)包括KOA在內(nèi)多種疾病[11]。膝關(guān)節(jié)滑膜組織釋放的炎性因子升高與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)退變密切相關(guān)，因此需要深入探索其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為探明肥胖和KOA的發(fā)生機(jī)制提供新的研究思路。

miRNA調(diào)控細(xì)胞的免疫、炎癥、發(fā)育、增殖、分化、凋亡等生理活動(dòng)及惡性腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[12-15]。因此，控制miRNA的表達(dá)可能發(fā)揮重要作用。研究表明，遺傳學(xué)調(diào)控方式是最關(guān)鍵的miRNA表達(dá)調(diào)控機(jī)制之一[16]。在肥胖和炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中，功能性的miRNA的基因啟動(dòng)子區(qū)異常升高或降低甲基化狀態(tài)可起重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，肥胖KOA患者滑膜組織中miR-203的基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低，而其在滑膜組織中表達(dá)增高。與本研究類似的是，RA滑膜成纖維細(xì)胞中miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)同樣呈現(xiàn)低甲基化[5]。以上研究提示，基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低和miR-203的表達(dá)增高在關(guān)節(jié)滑膜炎癥發(fā)展過程中扮演重要角色。

研究發(fā)現(xiàn)，與正常個(gè)體比較，肥胖者體內(nèi)更易于產(chǎn)生IL-1β，IL-6，IL-18及TNF-α[5，18]。這些因子可能對(duì)肥胖相關(guān)疾病有重要影響[19-20]。早期研究表明，肥胖對(duì)軟骨代謝有較大影響[21]，且IL-1β在OA患者體內(nèi)被高度誘導(dǎo)，并且與BMI正相關(guān)[22]。本研究肥胖組滑膜液中3種促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于正常對(duì)照組，與以上研究結(jié)果一致。提示體重的增加對(duì)于骨關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性水平有正向影響。另外，最新研究表明miR-203調(diào)節(jié)肥胖脂肪組織代謝，且miR-203可以抑制抗炎信號(hào)IFN-γ[23]。本研究顯示miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與BMI和促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α均呈負(fù)相關(guān)，而miR-203表達(dá)升高與BMI和促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)，說明miR-203可能在肥胖KOA滑膜中扮演促進(jìn)炎癥的作用，且調(diào)節(jié)機(jī)制可能是miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化水平。類似的是，RA患者滑膜成纖維細(xì)胞中miR-203被上調(diào)[5];另外，RA滑膜成纖維細(xì)胞的高水平炎癥可能通過miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化來調(diào)節(jié)，而直接的證據(jù)也表明miR-203表達(dá)改變能調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1和促炎因子IL-6水平[5]。以上研究提示miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)節(jié)的miR-203水平上調(diào)與肥胖KOA患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性水平密切相關(guān)。

綜上所述，miR-203可作為KOA疾病的重要調(diào)控因子。滑膜組織中miR-203表達(dá)上調(diào)，且與BMI呈正相關(guān)，提示miR-203在肥胖KOA疾病防治中的潛在作用。但仍需進(jìn)一步設(shè)計(jì)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探明miR-203在肥胖KOA疾病中的作用和下游調(diào)控機(jī)制。

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（收稿日期：2019-11-11 ?本文編輯：顧家毓）