周 勇

(中糧生物科技股份有限公司，安徽蚌埠 233010)

0 引言

隨著人們對環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展關(guān)注度的提高，燃料乙醇生產(chǎn)過程中存在的廢水排放污染和水處理成本高等問題日益凸顯[1]。每生產(chǎn)1 t燃料乙醇約產(chǎn)生20 t廢水[2]，且隨著燃料乙醇生產(chǎn)規(guī)模擴大，待處理廢水量也逐年增加。燃料乙醇清潔生產(chǎn)迫在眉睫。

燃料乙醇生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢水包括清液和二次凝水等。其中，清液含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，若能被回用作為酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)基溶劑，可以降低生產(chǎn)用水成本[3]；二次凝水具有固形物含量少、金屬離子濃度低等特點，具有再生回用潛力[4]。但是，乙醇生產(chǎn)廢水中可能含有對酵母菌生長和生產(chǎn)乙醇具有抑制作用的有機酸等組分。這些有機酸的來源包括發(fā)酵培養(yǎng)基組分和酵母菌細胞自身的新陳代謝產(chǎn)物[5-6]。目前，尚未見清液中有機酸種類和含量的報道，但Sagne等[7]和Couallier等[8]在二次凝水中已檢測出甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸，且乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸對酵母菌發(fā)酵表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。這些有機酸屬于弱電解質(zhì)，在水溶液中發(fā)生不完全解離[9]。其中，未解離的有機酸通過擴散方式進入胞內(nèi)，并在胞內(nèi)發(fā)生解離，導(dǎo)致胞內(nèi)質(zhì)子濃度增加，膜電位降低；為維持最佳胞內(nèi)酸堿水平，細胞必須通過ATP 產(chǎn)生更多能量，使過量的質(zhì)子被運出胞外；當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)供給不足時，細胞代謝水平降低，酵母菌發(fā)酵過程受阻[2,10]。因此，去除部分有機酸有利于酵母菌生長和發(fā)酵[6]。目前，發(fā)酵廢水的處理方法主要有膜分離和離子交換等[7,11-13]。膜分離法對小分子化合物的選擇性分離仍較困難，且存在膜污染等問題；離子交換法的處理速率快，但需要篩選合適的樹脂，即要求粒度均勻、強度好、耐溫性能好、水處理量大等[14-15]。因此，本研究以夏季和秋季燃料乙醇生產(chǎn)過程的清液和二次凝水為研究對象，分析樣品中的有機酸種類及含量，解析不同有機酸對酵母菌生長和乙醇生產(chǎn)的影響，并對D318離子交換樹脂處理前后水樣回用于乙醇發(fā)酵過程的結(jié)果進行比較，評價清液和二次凝水回用于酵母菌乙醇發(fā)酵過程的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

水樣：二次凝水和清液分別于2019年5月(夏季)和8月(秋季)取自中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司的乙醇生產(chǎn)車間。

菌株：釀酒酵母SaccharomycecerevisiaeNJ-2019，分離自安琪耐高溫釀酒高活性干酵母,燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)菌株。

試劑：酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸，琥珀酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、延胡索酸、蘋果酸、磷酸二氫鉀、磷酸均為國產(chǎn)分析純。乙腈和甲醇為國產(chǎn)色譜級。

儀器：離心機(Avanti J-26S XP，Beckman)、恒溫培養(yǎng)箱(LRH-150型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、恒溫搖床(QHZ-98BS型，常州普天儀器制造有限公司)、超凈工作臺(YJ-VS-2型，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司)、酶標儀(Multiskan FC型，Thermo Fisher Scientific)、液相色譜(1290型，Agilent)、生物傳感儀(SBA-40C型，山東微生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

培養(yǎng)條件：自然pH值，溫度30℃，200 r/min，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，作為備用菌種。

1.2.2 乙醇發(fā)酵

培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，20%葡萄糖。

培養(yǎng)條件：分別以純水、清液、二次凝水，以及處理后的清液和二次凝水為溶劑配制發(fā)酵培養(yǎng)基，用2%鹽酸溶液或者2%氫氧化鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH值至3.7；接種(接種量為10%)后置30℃，100 r/min搖床發(fā)酵；每隔4—6 h取樣，于600 nm處測定樣品OD值；將樣品在8 000×g條件下離心，取上清液，用SBA-40C生物傳感儀檢測上清液中的乙醇濃度和葡萄糖濃度[16-17]。

1.2.3 有機酸的測定

(1)標準溶液配制

以流動相溶解各種有機酸標準品，定容至25 mL容量瓶中，此溶液為1.0 mg/mL單標儲備液。其中，乙酸、琥珀酸、丙酸、蘋果酸和檸檬酸流動相為甲醇-水(V∶V=55∶45)，延胡索酸流動相為乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液(V∶V=20∶80)，乳酸流動相為0.05%磷酸-甲醇(V∶V=90∶10)。臨用前用流動相稀釋濃度依次為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL標準液，測定3組平行數(shù)據(jù)，取平均值繪制標準曲線。

(2)樣品測定

乙酸、琥珀酸、丙酸、蘋果酸和檸檬酸用液相色譜法測定：色譜柱為 Prevail 有機酸分析柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm,Grace,USA)，流動相流速為 1 mL/min，進樣體積為20 μL，柱溫為 25℃，利用紫外檢測器檢測，波長為 215 nm。其中，琥珀酸、丙酸和檸檬酸的最低檢出限為0.05 g/L；乙酸、蘋果酸的最低檢出限為0.02 g/L。

延胡索酸：采用C18色譜柱,流動相:乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液(V∶V=20∶80)，檢測波長210 nm，其他條件同上。延胡索酸的最低檢出限為0.000 5 g/L。

乳酸：C18色譜柱,流動相為0.05%磷酸-甲醇(V∶V=90∶10)，檢測波長為210 nm，其他條件同上。乳酸的最低檢出限為0.02 g/L。

1.2.4 單一種有機酸對乙醇生產(chǎn)的影響

為評估清液和二次凝水的回用潛力，分別考察單一種有機酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響。根據(jù)清液和二次凝水樣品有機酸檢測結(jié)果，分別設(shè)置單一種有機酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度梯度，考察其對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量的影響。培養(yǎng)基中初始有機酸濃度為0時的OD600值和乙醇產(chǎn)量計為100%。

1.2.5 清液和二次凝水直接回用對乙醇生產(chǎn)的影響

在1.2.4節(jié)的試驗基礎(chǔ)上，進一步考察混合有機酸對乙醇生產(chǎn)的影響。以純水為溶劑配制發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照；以混合有機酸-水溶液為溶劑配制發(fā)酵培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸的濃度與樣品清液或二次凝水相同，獲得模擬清液和模擬二次凝水；分別以清液和二次凝水樣品為溶劑，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，研究其對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響。其中釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019比生長速率μ被定義為單位質(zhì)量的細胞在單位時間內(nèi)所增加的細胞質(zhì)量，

μ=(lnNt-lnN0)/t,

(1)

其中，μ為比生長速率，h-1；N0、Nt分別為培養(yǎng)前后的生物量，t為時間，h。

1.2.6 有機酸的分離

利用大孔弱堿性陰離子交換樹脂(D318，安徽皖樹化工有限公司)對夏季取樣的清液和二次凝水進行靜態(tài)吸附處理，即將樹脂與待處理液體以質(zhì)量體積比1∶20充分混勻，密塞，置于水浴振蕩器中，30℃振蕩2 h，然后過濾獲得濾液。濾液用流動相稀釋，離心、定容、搖勻后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后測定其有機酸含量。

1.2.7 處理后的清液和二次凝水回用對乙醇生產(chǎn)的影響

以處理后的水樣作為溶劑，配制釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019的發(fā)酵培養(yǎng)基;以未處理清液和二次凝水為溶劑時的酵母菌比生長速率為對照，測定和比較酵母菌培養(yǎng)8 h時的比生長速率,以及發(fā)酵8 h時的乙醇產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線測定結(jié)果

根據(jù)測試結(jié)果計算和擬合得到的乙酸、琥珀酸、丙酸、蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸和乳酸的回歸方程和

相關(guān)系數(shù)如表1所示。從表1可以看出，7種有機酸在濃度為0.2—1.0 mg/mL時，液相色譜的峰面積與其濃度均呈線性關(guān)系，且此測試條件下獲得的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5。說明該測試方法適用于含7種有機酸的樣品檢測。

表1 不同有機酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

Table 1 Regression equation and correlation coefficient of different organic acids

有機酸Organic acids回歸方程Regression equations相關(guān)系數(shù)Correlation coefficients乙酸Acetic acidy=477.85x-0.25R2=1.000 0琥珀酸Succinic acidy=675.35x-1.67R2=0.999 8丙酸Propionic acidy=484.15x-1.99R2=0.999 9蘋果酸Malic acidy=848.3x-0.46R2=1.000 0檸檬酸Citric acidy=1244.9x-2.67R2=1.000 0延胡索酸Fumaric acidy=114044x+66.61R2=0.999 8乳酸Lactic acidy=719x+1.78R2=1.000 0

2.2 樣品中有機酸含量測定結(jié)果

如表2所示，乙酸、乳酸、丙酸和檸檬酸是清液中的主要有機酸。現(xiàn)有報道中，乙酸、琥珀酸、乳酸、丙酸、延胡索酸、蘋果酸和檸檬酸對酵母菌產(chǎn)生抑制作用的臨界濃度分別為2，2，4，1.5，10，5和15 g/L[2,18-20]。表明清液中的乙酸、乳酸、丙酸和檸檬酸可能是酵母菌生長和發(fā)酵的抑制劑。乙酸和乳酸是二次凝水樣品中的主要有機酸，且含量低于目前報道的抑制臨界濃度，表明二次凝水可能具有良好的回用潛力。

表2 清液和二次凝水中有機酸種類及含量(g/L)

Table 2 Composition and content of organic acids in supernatant and secondary condensate (g/L)

水樣 Water samples季節(jié)Seasons乙酸Acetic acid琥珀酸Succinic acid乳酸Lactic acid丙酸Propionic acid延胡索酸Fumaric acid蘋果酸Malic acid檸檬酸Citric acid清液Supernatant夏季Summer2.83±0.020.42±0.037.02±0.022.28±0.02--2.12±0.03秋季Autumn0.54±0.02-2.06±0.040.20±0.010.01±0.010.29±0.011.19±0.02二次凝水Secondary condensate夏季Summer0.81±0.01-0.03±0.01----秋季Autumn0.18±0.01------

注：“-”表示低于檢出限

Note："-" indicated that the sample concentration was lower than the detection limit

2.3 單一種有機酸對乙醇生產(chǎn)的影響

2.3.1 乙酸

根據(jù)夏季和秋季的清液和二次凝水樣品中檢測到的乙酸濃度，設(shè)計乙酸在培養(yǎng)基中的初始濃度梯度為0.0，0.2，1.0，3.0 g/L，考察乙酸濃度對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖1所示：當初始乙酸濃度從0.0 g/L遞增至3.0 g/L時，菌體OD600值略有降低，而乙醇產(chǎn)量無明顯變化。當初始乙酸濃度為0.2 g/L時，OD600值降低2.46%；初始乙酸濃度為3.0 g/L時，OD600值降低4.16%。表明乙酸單獨存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中時，對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019發(fā)酵生產(chǎn)乙醇未表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

圖1 乙酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長及其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

Fig.1 Effects of acetic acid on the growth and ethanol production ofS.cerevisiaeNJ-2019

2.3.2 乳酸

根據(jù)夏季和秋季的清液和二次凝水樣品中檢測到的乳酸濃度，設(shè)計乳酸在培養(yǎng)基中的初始濃度分別為0.0，0.2，2.0，7.0 g/L，考察乳酸濃度對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖2所示：當乳酸初始濃度在0.0—2.0 g/L時，乳酸對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量無顯著影響；當乳酸初始濃度為7.0 g/L時，OD600值降低8.15%，乙醇產(chǎn)量降低4.66%，表明培養(yǎng)基中乳酸初始濃度達到7.0 g/L時，單一的乳酸可以明顯抑制乙醇生產(chǎn)。

2.3.3 丙酸對乙醇生產(chǎn)的影響

根據(jù)夏季和秋季的清液和二次凝水樣品中檢測到的丙酸濃度，設(shè)計丙酸在培養(yǎng)基中的初始濃度分別為0.0，0.2，1.0，2.5 g/L，考察丙酸濃度對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖3所示：當丙酸初始濃度在0.0—0.2 g/L時，丙酸對OD600值和乙醇產(chǎn)量無顯著影響；當丙酸初始濃度為1.0 g/L時，OD600值降低20.71%，乙醇產(chǎn)量降低16.49%，表明培養(yǎng)基中丙酸濃度達到1.0 g/L時，單一的丙酸對乙醇生產(chǎn)抑制作用明顯。

圖2 乳酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長及其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

Fig.2 Effects of lactic acid on the growth and ethanol production ofS.cerevisiaeNJ-2019

圖3 丙酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長及其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

Fig.3 Effects of propionic acid on the growth and ethanol production ofS.cerevisiaeNJ-2019

2.3.4 檸檬酸對乙醇生產(chǎn)的影響

根據(jù)夏季和秋季的清液和二次凝水樣品中檢測到的檸檬酸濃度，設(shè)計檸檬酸在培養(yǎng)基中的初始濃度分別為0.0，0.2，1.5，2.5 g/L，考察檸檬酸濃度對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖4所示：當檸檬酸初始濃度為0.0—2.5 g/L時，發(fā)酵結(jié)束后菌體OD600值和乙醇產(chǎn)量無顯著變化。表明單一的檸檬酸對乙醇生產(chǎn)無顯著影響。

2.3.5 琥珀酸對乙醇生產(chǎn)的影響

根據(jù)夏季和秋季的清液和二次凝水樣品中檢測到的琥珀酸濃度，設(shè)計琥珀酸在培養(yǎng)基中的初始濃度分別為0.0，0.2，0.5，1.0 g/L，考察琥珀酸濃度對酵母OD600值和乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖5所示：當琥珀酸初始濃度為0.0—1.0 g/L時，發(fā)酵結(jié)束后菌體OD600值和乙醇產(chǎn)量無顯著變化。表明單一的琥珀酸未對乙醇生產(chǎn)產(chǎn)生顯著影響。

圖4 檸檬酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長及其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

Fig.4 Effects of citric acid on the growth and ethanol production ofS.cerevisiaeNJ-2019

圖5 琥珀酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長及其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

Fig.5 Effects of succinic acid on the growth and ethanol production ofS.cerevisiaeNJ-2019

2.4 清液和二次凝水直接回用對乙醇生產(chǎn)的影響

如圖6所示，對照組酵母菌SaccharomyceNJ-2019的比生長速率μ為0.21，模擬清液和模擬二次凝水的比生長速率分別為0.18和0.19，混合有機酸對酵母菌的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這可能是由于有機酸之間的協(xié)同作用[21-22]。從圖6還可以看出，模擬清液和模擬二次凝水得到的比生長速率μ均大于對應(yīng)的清液和二次凝水樣品，表明在清液和二次凝水中還含有其他種類的抑制劑。在進行樣品成分分析時，在清液、二次凝水中也檢測出了糠醛、雜醇等物質(zhì)，這些物質(zhì)可以通過與有機酸的協(xié)同作用來增強有機酸的抑制能力。因此，考慮去除或者部分去除清液和二次凝水中的有機酸。

經(jīng)過離子交換處理后，清液中除了仍含有2.13 g/L的乳酸，其余有機酸均低于檢測限，而二次凝水中均未檢測出有機酸。表明樣品中的乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸和琥珀酸已被大部分去除。

圖6 模擬液對釀酒酵母S.cerevisiae NJ-2019生長的影響

Fig.6 Effects of simulated liquids on the growth ofS.cerevisiaeNJ-2019

2.5 處理后清液和二次凝水回用對乙醇生產(chǎn)的影響

如表3所示，處理后的清液和二次凝水分別使酵母菌比生長速率提高14.22%和13.23%；其乙醇產(chǎn)量雖然仍低于純水，但與清液和二次凝水直接回用相比，可使乙醇發(fā)酵產(chǎn)量分別提高10.11%和9.85%。

表3 處理后清液和二次凝水回用對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長和乙醇產(chǎn)量的影響

Table 3 Effects of reusing treated supernatant and secondary condensate on the growth and ethanol production ofS.cerevisiaeNJ-2019

溶劑Solvent比生長速率μSpecific growth rate μ乙醇產(chǎn)量Ethanol production (%)純水Pure water0.21±0.0213.66±0.12清液Supernatant0.16±0.0310.50±0.34處理后清液Treated supernatant0.183±0.0111.56±0.33二次凝水Secondary condensate0.18±0.0211.68±0.21處理后二次凝水Treated secondary condensate0.204±0.0112.83±0.13

3 結(jié)論

本研究以燃料乙醇實際工業(yè)生產(chǎn)過程排放的清液和二次凝水為研究對象，分析其有機酸組成及其對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019乙醇發(fā)酵過程的影響，確定單一的乳酸和丙酸組分即可顯著抑制乙醇生產(chǎn)，乳酸和丙酸對釀酒酵母S.cerevisiaeNJ-2019生長和發(fā)酵的最低抑制濃度分別為7.0 g/L和1.0 g/L。去除或者部分去除清液和二次凝水中的有機酸能使乙醇發(fā)酵產(chǎn)量分別提高10.11%和9.85%。表明燃料乙醇發(fā)酵過程產(chǎn)生的清液和二次凝水具有回用的潛力，有利于實現(xiàn)乙醇生產(chǎn)過程節(jié)能減排。