p-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用機制

李 路，李 蔚，車金鑫，歐陽秋麗，陶能國*

（湘潭大學化工學院生物與食品工程系，湖南 湘潭 411105）

柑橘是世界上重要的經(jīng)濟作物之一，近10多年來，我國柑橘的栽培面積、產量均居世界第一[1]。采后柑橘果實在貯運過程中極易受到病原菌如指狀青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（P. italicum）和酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）的侵染[2-3]。近年來，柑橘酸腐病在各地的發(fā)病率逐漸提高，特別是在果實褪綠階段和多雨季節(jié)，造成巨大經(jīng)濟損失[4]。目前，柑橘酸腐病的防治仍以化學殺菌劑為主，鄰苯基苯酚鈉、雙胍鹽和丙環(huán)唑雖表現(xiàn)出較好的防控效果，但化學殺菌劑存在損害果實品質、對人體致癌及部分國家法律限制等影響[5]。因此，急需篩選和開發(fā)安全、高效的殺菌劑用于柑橘采后酸腐病的防治。

近年來，植物精油類果蔬防腐保鮮劑的研究和應用廣受關注。植物精油又稱香精油、芳香油和揮發(fā)油，是從植物組織中提取的一類有較強揮發(fā)性的植物次生代謝產物。因其具有較強的抑菌能力、毒性低、對環(huán)境影響小等優(yōu)點，被視為傳統(tǒng)合成殺菌劑的替代物[6]。據(jù)報道，一些精油對果蔬采后病原真菌的生長和病害的防控均表現(xiàn)出良好的應用前景，如肉桂精油對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、蘋果青霉病菌（P. expansum）等重要果蔬致病真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有較強的抑制作用[7];柑橘精油通過破壞意大利青霉（P. italicum）和指狀青霉（P. digitatum）菌絲體的細胞膜完整性，導致胞內組分外泄，從而抑制病原菌生長[8];百里香精油能延緩番茄采后灰霉病、桃果實褐腐病、芒果焦腐病的發(fā)病進程[9-11];茶樹精油不僅能抑制病原菌生長，還能通過提高活性氧和抗氧化酶水平來增強草莓果實本身的抗病性，從而顯著降低草莓灰霉病和軟腐病的病情指數(shù)[12]。

茴香精油是從茴香（Foeniculum vulgareMill.）植株的根、葉、果實等部位提取的一類化學組分，具有抑菌和抗氧化活性[13-14]，已在臨床治療和食品保鮮中有初步應用[15-16]。p-茴香醛是茴香精油中的重要組分。研究表明，p-茴香醛對多種白色念珠菌屬（Candidasp.）菌株表現(xiàn)出較好的抑制效果，最低抑菌質量濃度從250～600 μg/mL不等[17]。Caccioni等[18]研究發(fā)現(xiàn)，p-茴香醛對多種果蔬采后致病真菌有不同程度的抑制作用，其中，抑制灰霉病菌（B. cinerea）、桃褐腐病菌（Monilinia laxa）和桃軟腐病菌（Rhizopus stolonifer）孢子萌發(fā)的最低質量濃度為1 000 μg/mL，抑制指狀青霉（P. digitatum）孢子萌發(fā)的最低質量濃度為500 μg/mL，抑制梨形毛霉（Mucor piriformis）、擴展青霉（P. expansum）和意大利青霉（P. italicum）孢子萌發(fā)的最低質量濃度為250 μg/mL;抑制上述病原菌菌絲體生長的最低質量濃度均為1 000 μg/mL。

本研究擬通過倍半稀釋法評價p-茴香醛對柑橘酸腐病菌的體外抑菌效果;并通過活體實驗測定p-茴香醛對人工接種酸腐病菌的柑橘果實發(fā)病情況的防控效果;進一步從病原菌菌絲體細胞壁完整性、細胞膜通透性和形態(tài)學角度對p-茴香醛抑制酸腐病菌的作用機制進行初步分析，為柑橘采后酸腐病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii），分離自柑橘酸腐病發(fā)病果實，保存于湘潭大學化工學院生物食品工程系。

砂糖橘（Citrus reticulateBlanco）于2018年11月購自湘潭大學周邊柑橘種植園。

p-茴香醛（分析純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司;碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液（1 mg/mL）北京索萊寶科技有限公司;堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 貝博（上海）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

WFZ UV-2802S紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司;Nikon DS-FI2熒光顯微鏡 尼康儀器（上海）有限公司;F97 pro熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司;JSM-6360LV高低真空掃描電子顯微鏡日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

菌種的活化：將-80 ℃保存的柑橘酸腐病菌在PDA平板上進行活化，置于恒溫培養(yǎng)箱中（28±2）℃培養(yǎng)4～5 d。

孢子懸浮液的配制：在平板中加入滅菌水刮取菌絲和孢子，滅菌擦鏡紙濾除菌絲后，用血球計數(shù)板將孢子懸浮液調至5×106個/mL。

1.3.2 酸腐病菌生長情況分析

采用倍半稀釋法測定p-茴香醛對酸腐病菌生長的影響[8]。在滅菌后的PDA培養(yǎng)基中加入p-茴香醛，使其終質量濃度分別為0（對照）、0.14、0.28、0.56、1.12、2.24 g/L和4.48 g/L。加入體積分數(shù)0.05%吐溫-80，混勻后迅速倒入培養(yǎng)皿，制成含藥平板。用打孔器打取直徑6 mm的酸腐病菌菌餅，并將菌餅倒貼在含藥平板中央，置于恒溫培養(yǎng)箱中（28±2）℃培養(yǎng)5 d。用十字交叉法每日測量菌落直徑。培養(yǎng)2 d后菌絲生長完全被抑制的p-茴香醛最低質量濃度定義為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），培養(yǎng)4 d后菌絲生長完全被抑制的p-茴香醛最低質量濃度定義為最低殺菌濃度（minimum fungicidal concentration，MFC）。按公式（1）計算p-茴香醛對酸腐病菌的生長抑制率。

式中：dc為對照組的菌落直徑平均值/cm;dt為處理組的菌落直徑平均值/cm。

1.3.3 采后柑橘果實酸腐病發(fā)病率測定

采用人工接種法測定p-茴香醛對柑橘果實酸腐病發(fā)病率的影響[19]。選擇成熟度、大小一致且無傷口的柑橘果實，用體積分數(shù)2% NaClO浸泡2 min，滅菌水漂洗后晾干。用消毒后的手術刀在柑橘果實赤道板的位置劃兩個2 mm×2 mm大小、2 mm深的十字型傷口，并在傷口處接種10 μL孢子懸浮液（5×106個/mL），靜置4 h。將果實浸泡在含質量濃度為0、MFC、10 MFCp-茴香醛的果蠟中5 min，每個質量濃度處理組含10 個果實，在（28±2） ℃、相對濕度85%～90%條件下保濕培養(yǎng)13 d，根據(jù)公式（2）計算果實發(fā)病率。

1.3.4 酸腐病菌細胞壁完整性分析

采用山梨醇保護實驗測定細胞壁完整性的恢復性[20]。在含藥平板中加入終濃度為0.8 mol/L的山梨醇，接種直徑6 mm的菌餅，（28±2）℃恒溫培養(yǎng)5 d，每日測定菌落直徑并計算病原菌的生長抑制率。

采用AKP試劑盒測定胞外AKP活力。將0.1 mL孢子懸浮液（5×106個/mL）接種至10 mL PDB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d后，加入p-茴香醛，使其終質量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC，（28±2）℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、30、60 min和120 min后取樣，4 ℃、4 000×g離心10 min，取上清液依照AKP試劑盒說明書的方法測定520 nm波長處的吸光度，并按公式（3）計算AKP活力。

式中：A1為樣品管吸光度;A2為對照管吸光度;A3為標準管吸光度;A4為空白管吸光度。

1.3.5 酸腐病菌細胞膜通透性分析

采用PI染色法檢測菌絲體細胞膜通透性[21]。將1 mL孢子懸浮液（5×106個/mL）重新接種于100 mL PDB培養(yǎng)基中，（28±2）℃恒溫振蕩培養(yǎng)1 d后收集菌絲體，懸浮于100 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 7.0）中。加入p-茴香醛使其終質量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC。（28±2）℃分別培養(yǎng)0、30、60 min和120 min后，將混合物4 ℃、4 000×g離心10 min，收集菌絲體。PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）沖洗2 次后，用10 μg/mL PI染色10 min，收集菌絲體并用PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）漂洗3 次除去殘余染料。用激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為546 nm和590 nm的熒光分光光度計檢測菌絲體的熒光值，并用熒光顯微鏡進行觀察和拍攝。按公式（4）將熒光值換算成相應的熒光值倍數(shù)。

式中：N為熒光值倍數(shù);FV1為樣品管熒光值;FV2為對照管熒光值。

1.3.6 酸腐病菌菌絲體形態(tài)觀察

用掃描電子顯微鏡觀察酸腐病菌菌絲體的形態(tài)[21]。按1.3.2節(jié)的方法配制p-茴香醛質量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC的平板，將6 mm直徑的酸腐病菌菌餅接種在平板中央，（28±2）℃培養(yǎng)4 d后切下菌落。用體積分數(shù)3%戊二醛磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）固定，4 ℃放置24 h。取出后用PBS（pH 6.8）進行漂洗，再分別在體積分數(shù)30%、50%、70%、95%乙醇溶液中進行梯度脫水，每次20 min。最后用無水乙醇處理45 min。真空冷凍干燥后噴金，用掃描電子顯微鏡在加速電壓30 kV下觀察菌絲體形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010軟件處理3 組平行數(shù)據(jù)，得到平均值與標準差，用Origin 7.5軟件進行繪圖，并用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，用Ducan新復極差測驗在0.05水平分析差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 p-茴香醛對酸腐病菌生長的影響

表 1 不同處理對酸腐病菌生長抑制率的影響Table 1 Effect of different treatments on the growth inhibition rate of G. citri-aurantii

p-茴香醛處理對酸腐病菌的生長具有很強的抑制作用，對照組的生長抑制率均為0，且質量濃度越大，對病原菌的生長抑制率越高（表1）。其中，2.24 g/L和4.48 g/Lp-茴香醛對病原菌的抑制率顯著高于其他質量濃度p-茴香醛處理組（P＜0.05）。培養(yǎng)2 d和4 d后，4.48 g/Lp-茴香醛能完全抑制病原菌的生長，因此MIC和MFC均為4.48 g/L。

2.2 p-茴香醛對采后柑橘果實酸腐病發(fā)病率的影響

人工接種4 d后，對照組和p-茴香醛處理組的柑橘果實均發(fā)生腐爛現(xiàn)象，隨著貯存時間延長，果實發(fā)病率逐漸提高（圖1）。接種后10～13 d，10 MFC（44.80 g/L）p-茴香醛處理組的果實發(fā)病率均保持在30%左右。接種13 d后，其發(fā)病率（30%）顯著低于對照組和MFC（4.48 g/L）p-茴香醛處理組（100%）（P＜0.05）。說明10 MFCp-茴香醛處理能有效延緩柑橘酸腐病的發(fā)病進程。

圖 1 p-茴香醛對接種酸腐病菌柑橘果實發(fā)病率的影響Fig. 1 Effect of p-anisaldehyde on the disease incidence of artificially inoculated citrus fruit

2.3 p-茴香醛對酸腐病菌細胞壁完整性的影響

外源添加保護劑山梨醇后，p-茴香醛對病原菌的生長抑制率也見表1。與未添加山梨醇的p-茴香醛處理組相比，添加山梨醇的p-茴香醛處理組菌絲生長抑制率沒有顯著降低，說明山梨醇不能緩解p-茴香醛對酸腐病菌生長的抑制程度。

圖 2 p-茴香醛對酸腐病菌菌絲體胞外AKP活力的影響Fig. 2 Effect of p-anisaldehyde on extracellular AKPase activity of G. citri-aurantii

p-茴香醛處理對酸腐病菌胞外AKP活力的影響見圖2。真菌細胞壁被破壞時，胞內AKP泄露至胞外，因此胞外AKP活力的變化能反映細胞壁的損傷情況。30 min后，MIC（4.48 g/L）和1/2 MIC（2.24 g/L）p-茴香醛處理組的AKP活力均顯著高于對照組。MICp-茴香醛處理60 min和120 min后，病原菌胞外AKP活力分別為（3.54±0.11）U/g和（3.55±0.21）U/g，顯著高于1/2 MICp-茴香醛處理組（（3.16±0.10）U/g和（3.21±0.08）U/g）和對照組（（3.11±0.19）U/g和（3.01±0.15）U/g）（P＜0.05）。綜合以上結果可以看出，MICp-茴香醛能對病原菌細胞壁造成嚴重損傷。

2.4 p-茴香醛對酸腐病菌細胞膜通透性的影響

p-茴香醛處理對病原菌細胞膜通透性的影響見圖3。由于PI染料不能穿過正常的細胞膜，因此菌絲體細胞膜損傷后，在熒光顯微鏡下呈紅色[21]。30 min時，p-茴香醛處理的菌絲體在熒光顯微鏡下均未觀察到明顯的紅色熒光（圖3A），MICp-茴香醛處理組菌絲體熒光值倍數(shù)約為對照組的1.53 倍（圖3B）。而60 min時，MICp-茴香醛處理組的菌絲體熒光值倍數(shù)約為對照組的1.49 倍，熒光顯微鏡下也觀察到部分菌絲體呈紅色，表明細胞膜被嚴重損傷。p-茴香醛處理120 min時，菌絲體細胞膜的破壞程度進一步加劇，此時，1/2 MICp-茴香醛處理組熒光值倍數(shù)（1.30±0.03）顯著高于對照組（1.03±0.05），但顯著低于MICp-茴香醛處理組（1.46±0.12）（P＜0.05）。PI染色后的熒光圖片和熒光值倍數(shù)均證實p-茴香醛造成病原菌細胞膜的損傷。

圖 3 p-茴香醛對酸腐病菌菌絲體細胞膜通透性的影響Fig. 3 Effect of p-anisaldehyde on membrane permeability of G. citri-aurantii

2.5 p-茴香醛對酸腐病菌菌絲體形態(tài)的影響

p-茴香醛處理對酸腐病菌菌絲體的形態(tài)有明顯影響，對照組菌絲體飽滿呈圓柱狀，粗細均勻（圖4A）;而經(jīng)過p-茴香醛處理的菌絲體形態(tài)均發(fā)生改變。1/2 MICp-茴香醛處理的菌絲體表面出現(xiàn)明顯褶皺（圖4B）;MICp-茴香醛處理的菌絲體表面形態(tài)變化更為明顯，呈現(xiàn)不規(guī)則扭曲和干癟狀（圖4C）。這些變化說明質量濃度更高的p-茴香醛對菌絲體造成的損傷更大，導致胞內組分外泄。

圖 4 p-茴香醛對酸腐病菌菌絲體形態(tài)的影響Fig. 4 Effect of p-anisaldehyde on morphology of G. citri-aurantii

3 討 論

近年來，安全而高效的柑橘酸腐病防治方法（如植物精油、生防菌等）引起廣泛關注[22-24]。Regnier等[22]的研究表明，1 000 μL/L孜然、檸檬草、棕櫚草等9 種植物精油能完全抑制柑橘酸腐病菌的菌絲生長，并能顯著降低果實發(fā)病率。Liu等[25]發(fā)現(xiàn)，人工接種5 d后，經(jīng)3 200 μL/L百里香精油處理的溫州蜜柑酸腐病發(fā)病率從78.1%降低至14.1%。Boubaker等[23]指出，供試的4 種百里香精油能不同程度地抑制柑橘酸腐病菌的生長和孢子萌發(fā)，抑菌效果與精油組分和百里香植株的種類有關。大量研究表明，茴香精油具有抑菌性，且p-茴香醛是茴香精油中的重要抑菌組分，對多種采后果蔬致病真菌有一定的抑制作用[13,18,26]。在本實驗中，p-茴香醛對柑橘酸腐病菌表現(xiàn)出很強的抑菌性，其MIC和MFC均為4.48 g/L，且活體實驗中貯存13 d的柑橘果實發(fā)病率從100%降低至30%左右，也證實了p-茴香醛對柑橘酸腐病的防治效果。值得注意的是，活體實驗中的p-茴香醛抑菌質量濃度高于離體實驗，這種現(xiàn)象在其他抑菌物質，如百里香精油、檸檬醛、殼聚（寡）糖和山梨酸鉀中也有相似情況[25,27-29]。原因可能與抑菌物質的滲透能力、病原菌在人工傷口的迅速擴繁等因素有關[19,30]。

殺菌劑對致病真菌的作用位點包括細胞壁、質膜、分泌因子、氨基酸生物合成、信號組分等[31]。其中細胞壁對真菌的生長和生存適應能力至關重要[32]。AKP通常在真菌的細胞質中合成，再被分泌到周質空間中，細胞壁的損傷會造成AKP泄漏至胞外基質[21]。Shao等[32]發(fā)現(xiàn)茶樹精油處理4 h即可造成灰霉病菌（B. cinerea）的胞外AKP活力顯著上升，推斷此時菌絲細胞壁已被破壞。而Tang Xu等[21]用脫氫乙酸鈉處理柑橘酸腐病菌菌絲體后，胞外AKP活力并未升高，推測細胞壁不是脫氫乙酸鈉的抑菌靶標。本實驗中，MICp-茴香醛處理的菌絲體胞外AKP活力在60 min時顯著高于對照組，表明p-茴香醛破壞了菌絲體細胞壁完整性，導致AKP外泄。山梨醇是一種常用于維持真菌細胞滲透壓的保護劑，細胞壁的損傷在高滲透壓下得到緩解，因此以真菌細胞壁為作用位點的化學藥劑在山梨醇的保護作用下會降低其對真菌的抑制作用[33-34]。本實驗中，外源添加山梨醇后，p-茴香醛對酸腐病菌菌絲的生長抑制率并沒有顯著降低，部分甚至增加，因此推斷p-茴香醛還可能損傷病原菌細胞膜。大量研究表明，多數(shù)抑菌物質，如香芹酚、E-2-己烯醛、脫氫乙酸鈉均能對病原菌細胞膜通透性造成影響，導致細胞質、核酸和蛋白質泄漏[21,35-36]。在PI染色實驗中，PI通過受損的細胞膜與DNA嵌合，在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光;因此，熒光的強弱能一定程度反映細胞膜損傷的程度[37]。前人研究表明，多種精油的抑菌性與病原菌細胞膜通透性的增加有關[38]。本實驗中，隨著p-茴香醛處理質量濃度的增大和處理時間的延長，熒光逐漸增強，菌絲體細胞膜損傷程度表現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性，表明細胞膜是p-茴香醛重要的作用位點。且30 min時，MICp-茴香醛處理組菌絲體熒光值倍數(shù)約為對照組的1.53 倍，說明此時病原菌的細胞膜已被損傷，且細胞膜損傷的發(fā)生早于細胞壁。

綜上，p-茴香醛能顯著抑制柑橘酸腐病菌的生長，并能有效降低柑橘果實酸腐病的發(fā)病率。p-茴香醛先損傷酸腐病菌的細胞膜，再損傷其細胞壁，造成胞內物質外泄，進而影響細胞代謝，導致菌絲體凋亡。關于其對細胞功能的影響以及分子機制，還有待于進一步分析。